暴马桑黄羊毛甾醇14α-脱甲基酶基因的克隆、序列分析及原核表达

为深入了解暴马桑黄三萜合成途径的调控机理,基于前期测得的转录组数据,同时结合基因组数据(GenBank登录号为LNZH00000000.2),筛选得到暴马桑黄羊毛甾醇14α-脱甲基酶(lanosterol 14-alpha-demethylase,LSD)基因序列,并设计特异引物。以暴马桑黄菌丝体总RNA反转录得到的cDNA为模板,采用PCR技术克隆得到LSD基因cDNA序列全长,命名为SbLSD1(登录号为MN640689)。序列分析结果表明,SbLSD1基因cDNA序列全长1 746 bp,编码581个氨基酸,分子量为65.96 ku,没有信号肽,在53~75位氨基酸序列之间含有一个跨膜螺旋结构,属于P450超家族成员。系统发育分析表明,暴马桑黄LSD1蛋白和灵芝LSD蛋白同源性最高。将SbLSD1基因cDNA序列构建到原核表达载体pET-32a上,获得重组质粒pET-32a-SbLSD1,然后将其转入Escherichia coliBL21中进行SbLSD1蛋白诱导表达。SDS-PAGE结果显示,SbLSD1基因成功表达出蛋白,并在63~75 ku出现与预期大小一致的蛋白条带。通过对SbLSD1基因的克隆及表达分析,为进一步研究该基因在暴马桑黄三萜生物合成过程中的功能奠定基础。

唑类耐药白色念珠菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶基因的研究

目的探讨白色念珠菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)基因突变与对唑类抗真菌药物耐药的关系,从分子水平了解其耐药机制。方法纸片扩散法和NCCL公布的M-27方案测定耐药株对氟康唑和伊曲康唑的MIC;设计引物,PCR扩增唑类耐药白色念珠菌的CYP51基因;扩增产物测序并与Genbank序列相比较分析。结果扩增产物测序分析表明,成功扩增到白色念珠菌CYP51基因。与X13296株序列相比较,两个耐药株都存在有意义突变和无意义突变。两株菌共有22个碱基突变。与以往报道的相同,突变发生氨基酸替换的有F105L、K128T、Y133H、T199I、R267H、G464S和G467K。其中,两株菌都有Y132H和G467K突变。F71L、W244R、T311N和T352I为新发现的突变,未见报道。同时,也发现了9个未发生氨基酸替换的突变。结论白色念珠菌对唑类抗真菌药物的耐药与CYP51基因突变有关,且为多位点突变。

甾醇14α-脱甲基酶CYP51蛋白结构及其抗药性功能研究进展

禾谷镰孢菌(Fusarium gra minearum)是引起小麦赤霉病的主要病原真菌,其细胞色素P450甾醇14α-脱甲基酶(CYP51)是唑类杀菌剂作用的主要靶标蛋白。本文在简要介绍小麦赤霉病在中国发生危害与防控现状的基础上,重点探讨了甾醇14α-脱甲基酶的结构及功能、病原真菌对唑类杀菌剂的抗药性研究现状和抗药性治理研究进展,以期对小麦赤霉病的高效防治、减少或延缓抗药性的发生以及对抗药性的治理提供新的思路。

棉花中一个钝叶醇14α-脱甲基酶基因同源基因(GhCYP51G1)的克隆、序列特征和表达分析

为研究植物固醇在棉花纤维细胞生长发育中的作用和信号传导机制,通过筛选棉花EST数据库并对目标EST序列进行整合和分析,从陆地棉栽培品种徐州142正在发育的纤维中克隆了植物固醇合成途径的重要酶基因——钝叶醇14α-脱甲基酶基因的同源基因,命名为GhCYP51G1(GenBank登录号为EU727154)。该基因编码486个氨基酸残基,其分子量和等电点分别为55.2kD和8.87。推导的氨基酸序列与烟草、马铃薯和葡萄等物种中CYP51家族成员有较高的同源性。而且具有钝叶醇14α-脱甲基酶序列中的典型保守结构域,如多个底物结合位点和血红素结合域。说明该克隆基因是钝叶醇14α-脱甲基酶基因的同源基因。实时定量RT-PCR的结果表明GhCYP51G1基因在快速伸长期的纤维中具有较高的表达水平,而在子叶、雌蕊和雄蕊以及开花后6d胚珠、开花后0d和2d的胚珠纤维中表达水平较低。在开花后8d的纤维细胞中GhCYP51G1的表达水平最高,这些结果说明该基因在纤维细胞的伸长生长中具有重要作用。同时在纤维生长过程中,由于生长素能够下调GhCYP51G1基因的表达,暗示植物固醇在植物激素,特别是油菜素类固醇物质和生长素的相互作用中具有一定作用。

禾谷镰刀菌甾醇14α脱甲基酶基因cDNA克隆及生物信息学分析

克隆获得禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)2个甾醇14α脱甲基酶CYP51蛋白(CYP51A、CYP51B)基因c DNA序列,明确其氨基酸序列典型特征,为研究蛋白质结构及其抗药性机制奠定基础。采用RT-PCR技术,克隆2个CYP51蛋白基因c DNA序列,利用相关生物信息软件对其序列进行生物信息学分析。结果克隆到2条c DNA序列,长度分别为1 524、1 581 bp,分别编码507、526个氨基酸;2个蛋白分子量分别为57.5、59.3 ku,等电点分别为6.93、7.08,不稳定系数分别为49.43、39.05;2个蛋白均含有细胞色素P450家族成员典型的保守结构域;不具有信号肽的属于非分泌性蛋白,具有跨膜结构域,是亲水性蛋白;蛋白质二级结构最主要的结构元件是α螺旋、无规则卷曲,并散布于整个蛋白中;亚细胞定位预测显示,CYP51A蛋白主要位于内质网及高尔基体等细胞器中,而CYP51B主要位于细胞质中。研究结果将为进一步研究CYP51蛋白生物学功能及其蛋白结构生物学提供参考。

羊毛甾醇脱甲基酶变化导致假丝酵母耐药的分子生物学研究进展

假丝酵母是临床常见的条件致病菌 ,抗生素的滥用及放化疗和免疫抑制剂广泛使用 ,使得假丝酵母的感染机会增加 ,针对常见的吡咯类抗真菌药的耐药现象逐年增加。其耐药途径较多 ,包括细胞膜对药物的通透性下降 ,药物在细胞内降解 ,甾醇合成路径的改变 ,细胞膜的排出泵作用增强 ,甾醇合成酶的性质变化等。与假丝酵母耐药性相关的细胞色素 P- 45 0羊毛甾醇脱甲基酶的基因存在 4种改变 :(1)点突变 ;(2 )基因过度表达 ;(3)基因扩增 ;(4 )基因转换或有丝分裂重组 ,导致靶酶的生物学特性变化 ,及其与假丝酵母耐药性的相互关系。表明假丝酵母编码靶酶的基因的变化可导致靶酶一级结构改变和空间构象变化 ,影响药物对靶酶的亲和性 ,或导致靶酶量的变化 ,影响药物的作用 ,产生耐药性。

烟曲霉羊毛甾醇14α-去甲基化酶的三维同源结构建模及其分子对接研究

探究烟曲霉羊毛甾醇14α-去甲基化酶活性位点的结构特征.首次采用同源建模的方法构建了烟曲霉羊毛甾醇14α-去甲基化酶的三维结构,并通过Ramachandran和Profile-3D图验证了模型的可靠性.然后,利用已知的共结晶配体结构,准确定位了14α-去甲基化酶的活性位点,让伏立康唑与靶点进行对接.通过柔性分子对接方法首次阐明了14α-去甲基化酶抑制剂与靶酶活性位点的相互作用模式,明确了14α-去甲基化酶与该类抑制剂结合时起重要作用的氨基酸残基.本研究为基于烟曲霉14α-去甲基化酶三维结构的药物靶点设计提供重要的参考信息,同时也为抗真菌药的发展奠定坚实的理论基础.

基于真菌14α-去甲基化酶的非氮唑类抗真菌先导化合物的设计、合成及其体外抗真菌活性研究

基于真菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)活性位点的三维结构设计并合成了新型四氢异喹啉类抗真菌先导化合物.体外抗真菌活性研究显示:设计的先导化合物具有较好的抗真菌活性.其中化合物5f和5g对于5种测试菌的抗真菌活性强于或相当于对照药物氟康唑.先导分子通过与靶酶活性腔氨基酸残基的非共价键结合产生抗真菌作用,避免与血红素辅基Fe原子发生配位结合,为一类具有新作用机理的非氮唑类抗真菌先导化合物.本研究为抗真菌药物研究提供了新的结合方式及结构类型.

核素掺入研究氟康唑对真菌麦角甾醇生物合成的影响

目的 :用核素掺入结合放射自显影和液体闪烁计数方法 ,研究抗真菌药物氟康唑对真菌麦角甾醇生物合成的影响。方法 :取新鲜培养的新生隐球菌标准株分别与不同浓度氟康唑预培养 1 0 min后 ,加 [1 - 1 4C]乙酸钠振荡培养 3h,经皂化、提取、薄层展开 ,使角鲨烯、羊毛甾醇和麦角甾醇等分离后 ,用液体闪烁计数法测定上述各成分中 1 4C的掺入量 ,并计算药物对真菌麦角甾醇生物合成的半数抑制浓度 (IC50 )。结果 :在空白对照组中 ,1 4C主要掺入麦角甾醇 ,而经氟康唑作用后 ,真菌的麦角甾醇生物合成受阻 ,1 4C在麦角甾醇中的掺入减少 ,但在羊毛甾醇及其上游成分角鲨烯环氧化物中的积累增多 ,其含量变化均呈剂量依赖性。氟康唑对真菌麦角甾醇生物合成的 IC50 为 32 .1 7nmol/L。结论 :核素掺入法能定量考察羊毛甾醇 1 4 α-去甲基化酶抑制剂氟康唑对羊毛甾醇去甲基化反应的抑制作用 。

新型1,2,3,4-四氢异喹啉类化合物的合成及抗真菌活性研究

目的：设计合成新型四氢异喹啉类抗真菌化合物。方法：以3，4，5-三甲氧基苯乙胺为起始原料，经Pictet—Spengler反应、中和反应、取代反应、酸性裂解等反应合成目标化合物，并进行体外抗真菌活性研究。结果：设计合成了12个新型四氢异喹啉类化合物，12个目标化合物均为首次报道。所有目标化合物均有抗真菌活性，其中化合物6～8、10～12对4种测试菌的抗菌活性均强于或相当于氟康唑。结论：设计合成的目标分子是一类新型的抗真菌化合物。此类化合物具有进一步研究开发的价值。

暴马桑黄SbLSD基因克隆及差异表达分析

【目的】暴马桑黄是一种重要的药用资源,三萜是其发挥药用功效的主要成分,但是目前获取大量三萜仍然非常困难。通过对暴马桑黄三萜合成途径中的羊毛甾醇14α-脱甲基酶(lanosterol 14-alpha-demethylase,LSD)基因进行克隆及差异表达分析,以期深入了解暴马桑黄三萜合成的调控机理,进而提高三萜产量。【方法】采用PCR扩增得到LSD基因cDNA序列全长,利用生物信息学软件对该基因编码的氨基酸序列进行分析;采取同源重组方法构建原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,SDS-PAGE检测;qRT-PCR技术分析LSD基因在暴马桑黄不同发育阶段转录水平差异。【结果】暴马桑黄LSD基因cDNA全长1662 bp,编码553个氨基酸,相对分子量为62.26 kDa,命名为SbLSD(登录号为MN864180);跨膜区和亚细胞定位预测显示SbLSD蛋白是在内质网和高尔基体发挥作用的跨膜蛋白;系统进化树结果表明暴马桑黄和灵芝的LSD蛋白同源性最高,符合物种经典分类;SDS-PAGE结果证实在62.26 kDa附近出现目的蛋白条带,说明所获得的基因可以成功表达出蛋白;从荧光定量分析结果中可以看出SbLSD基因转录水平在不同发育阶段有差异性,并且在子实体阶段该基因转录水平最高,与羊毛甾醇合成的基因变化规律相吻合。【结论】通过对SbLSD基因的分子鉴定解析,为进一步揭示该基因在暴马桑黄三萜合成途径中的功能奠定基础。

葛根素对膳食诱导的高胆固醇血症大鼠的血脂调节作用

目的:观察葛根素对膳食诱导的高胆固醇血症大鼠的血脂调节作用,并对其机制进行探索。方法:SD大鼠随机分为3组,正常组、模型组和葛根素组。模型组和葛根素组均给予富含胆固醇的饲料4周,葛根素组每天灌喂葛根素溶液(300mg·kg-1·d-1)。检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)的含量。荧光定量RT-PCR分析羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(HMGR),羊毛固醇14α-去甲基酶(CYP51),7α-羟化酶(CYP7A1)的mRNA转录水平。结果:葛根素显著降低高胆固醇膳食引起的血清胆固醇的升高,降低动脉粥样硬化指数,上调CYP7A1的mRNA转录水平,对HMGR和CYP51的转录水平没有影响。结论:这些数据表明葛根素能够降低血清胆固醇,减低动脉粥样硬化发生危险。其降低胆固醇的作用可能是通过促进胆固醇转化为胆酸实现的。

杨树炭疽病菌对多菌灵及3种DMIs杀菌剂的敏感性

采用菌丝生长速率法,测定了可引起杨树炭疽病的59株胶孢炭疽菌和4株炭疽菌对多菌灵、苯醚甲环唑、戊唑醇和三唑酮4种杀菌剂的敏感性。结果表明：59株胶孢炭疽菌对多菌灵、苯醚甲环唑、戊唑醇和三唑酮的EC_（50）值范围分别在0.037 1-0.130 1、0.102 5-1.680、0.069 1-1.917及3.053-38.59μg/m L之间,平均EC_（50）值分别为（0.066 4±0.013 1）、（0.374 1±0.254 8）、（0.681 2±0.442 1）和（19.82±6.200）μg/m L。胶孢炭疽菌对多菌灵的敏感性频率分布呈连续单峰曲线,表明尚未出现敏感性下降的群体;而对苯醚甲环唑和戊唑醇的敏感性频率分布呈现双峰,表明已出现敏感性下降的群体。4株炭疽菌对多菌灵、苯醚甲环唑、戊唑醇和三唑酮的最小EC_（50）值和最大EC_（50）值分别相差1.33、13.19、13.66和2.14倍,其中菌株Ca-4对苯醚甲环唑和戊唑醇的EC_（50）值均大于4μg/m L。不同寄主来源的胶孢炭疽菌对同种杀菌剂的敏感性之间无显著差异（P〉0.05）。Spearman’s秩相关分析表明,胶孢炭疽菌对苯醚甲环唑和戊唑醇的敏感性之间呈显著正相关性（ρ=0.665 5,P〈0.000 1）,对戊唑醇和三唑酮的敏感性之间也存在一定相关性（ρ=0.489 6,P〈0.000 1）,其余杀菌剂之间则均无相关性（P〉0.05）。研究结果对合理使用杀菌剂防治杨树炭疽病具有借鉴意义和参考价值。

酵母菌Y12667 ERG11基因删除及验证研究

采用同源重组的方法删除酵母菌Y12667内源ERG11基因,并用PCR、Western、细胞计数和GC-MS的方法分别在基因水平、蛋白水平、细胞水平和功能代谢水平进行验证.结果表明,本研究成功删除了酵母菌Y12667内源ERG11基因,该基因删除菌能稳定表达外源性白念珠菌ERG11基因的同源蛋白.因此,该基因删除菌可作为下一步靶酶蛋白功能研究的基因工程表达操作菌.

结合光谱法在DMIs类杀真菌剂筛选中的应用

为建立一种快捷和准确的方法用于新型杀真菌剂的筛选,以外源表达的稻瘟菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶为靶酶,以市售烯唑醇、戊唑醇、三唑醇、三唑酮为DMIs类杀真菌剂代表,分析了靶酶活性、靶酶纯度和靶酶浓度对二者结合光谱的影响,并与生物测试结果比较分析其可靠性。结果表明靶酶的高活性、无其他P450干扰和合适的靶酶浓度是获得准确结合光谱的必要条件。烯唑醇、戊唑醇、三唑醇、三唑酮与靶酶结合常数(Kd)分别为0.143μmol/L、0.24μmol/L、0.257μmol/L、0.307μmol/L,该结果与其对稻瘟菌生长抑制能力(120h-EC50)显著相关,证明结合光谱法可作为一种简便可靠的DMIs类杀真菌剂筛选方法。

抗真菌药物靶标及其抑制剂的研究进展

目的综述抗真菌药物靶标及其抑制剂的研究进展。方法本文结合自身研究工作,分析近5年文献,总结抗真菌药物靶标及其抑制剂的最新进展。结果β-1,3-葡聚糖合成酶、羊毛甾醇14α-去甲基化酶、N-肉豆蔻酰基转移酶和分泌型天冬氨酸蛋白酶是目前研究最为集中的抗真菌药靶,其抑制剂显示了良好的新药开发前景。结论优化现有药物化学结构和发现全新作用机制的先导化合物,对研发新一代抗真菌药物具有重要意义。

烟曲霉Cyp51A和Cyp51B生物学功能差异性分析

目的研究烟曲霉Cyp51A和Cyp51B的功能差异。方法利用系统发生分析研究烟曲霉Cyp51A和Cyp51B的进化关系,分别构建烟曲霉Cyp51A和Cyp51B编码基因的敲除菌株Δcyp51A和Δcyp51B,研究Δcyp51A和Δcyp51B在高温耐受性、伏立康唑敏感性和对大蜡螟幼虫致病力方面的差异性。结果系统发生分析显示,烟曲霉Cyp51A和Cyp51B进化距离较远。Δcyp51B对50℃的耐受性低于Δcyp51A和野生株。Δcyp51A对伏立康唑耐受水平下降程度明显高于Δcyp51B。Δcyp51B和Δcyp51A对大蜡螟幼虫致病力与野生株相比无显著性差异。结论Cyp51A和Cyp51B在烟曲霉高温耐受性和唑类药物耐受性中有功能差异。

新型哌嗪并[2,1-a]异喹啉类化合物合成及抗真菌活性的研究

设计、合成了36个新型哌嗪并[2,1-a]异喹啉类化合物,并测试了其体外抗真菌活性.结果表明所有化合物对5种临床致病真菌都有抗真菌活性.其中化合物5h,5j～5l,6g～6k和6l对除白念菌外的4种测试菌的抗真菌活性强于或相当于对照药氟康唑;特别是大多数目标化合物对于氟康唑无效的薰烟曲霉菌显示出较好抗真菌活性.对接研究显示所设计的目标化合物与靶酶活性腔中氨基酸功能残基结合.结果表明新型哌嗪并[2,1-a]异喹啉类化合物是一类全新结构类型的抗真菌化合物,为抗真菌药物研究提供了新的结构类型.

喷雾诱导沉默CYP51和Sdh基因对禾谷丝核菌生长和致病性的影响

由于缺少稳定的遗传转化体系,丝核菌致病相关基因的功能研究受到严重限制。本研究以防治丝核菌病害的常用杀菌剂靶标基因CYP51和Sdh为目标基因,体外合成禾谷丝核菌CYP51的3个同源基因以及Sdh的B、C、D亚基基因的dsRNA,采用喷雾诱导基因沉默(spray-induced gene silencing, SIGS)方法研究这6个基因产生的dsRNA对病菌生长和致病性的影响。结果表明,外源施加靶标基因dsRNA对禾谷丝核菌的生长和致病性均有抑制作用。在被侵染的大麦叶片上,外源dsRNA能够显著抑制病菌中对应基因的表达。100 ng·μL-1浓度的RcCYP51-3-dsRNA在大麦叶片上抑菌效果较为显著,且可以同时抑制3个RcCYP51同源基因的表达;RcSdhD-dsRNA同样可以抑制RcSdh三个亚基的基因表达,在50 ng·μL-1浓度时抑菌效果最好。本研究探索了一种抑制禾谷丝核菌基因表达的方法,为使用SIGS方法研究丝核菌基因功能打下基础。

白念珠菌临床株氟康唑敏感性试验与ERG11基因突变检测

目的了解白念珠菌临床株对氟康唑的敏感性,筛查临床菌株的ERG11突变,探讨其与耐药的关系。方法收集鉴定白念珠菌临床株,采用微量稀释法和药敏纸片法体外测定试验菌株对氟康唑的敏感性。分段扩增ERG11基因的第295～777 bp(483 bp)、第723～1204 bp(482 bp)和第1179～1667 bp(489 bp)等3个片段,并测序。结果共收集念珠菌80株,分离白念珠菌52株,52株白念珠菌均为敏感株。经测序的5株敏感白念珠菌ERG11基因共出现19处突变,其中14处为同义突变,其余5处错义突变(T495A、A530C、G640A、A945C、G1609A)分别可引起羊毛甾醇14α-去甲基酶的下列氨基酸改变:D116E、K128T、E165K、E266D、V488I。结论白念珠菌临床株对氟康唑敏感性较高;E165K和V488I可能与耐药无关。