羊毛硫细菌素生物合成基因簇的遗传分析

羊毛硫细菌素是一类核糖体合成且经翻译后修饰的具有生物活性的小肽,通常含有羊毛硫氨酸及β-甲基羊毛硫氨酸等稀有氨基酸。近年来随着来源于乳酸乳球菌的nisin(乳链菌肽)被广泛地用作天然食品防腐剂和对其研究的不断深入,羊毛硫细菌素已引起研究者广泛关注。因其无耐药性,羊毛硫细菌素还极有可能替代传统抗生素应用于生物医药领域。羊毛硫细菌素的生物合成基因包括结构基因、修饰基因、加工基因、转运基因、免疫基因、调节基因,它们成簇排列于产生菌的染色体或质粒上,构成数个转录单元。本文综述了近年来羊毛硫细菌素生物合成基因簇遗传分析的研究进展。

枯草芽孢杆菌SX3411产羊毛硫细菌素subtilomycin的初步鉴定与理化特性分析

为了确定分离得到的枯草芽孢杆菌SX3411(Bacillus subtilis SX3411)具有产羊毛硫细菌素subtilomycin的能力和subtilomycin的理化特性。利用滤纸片扩散法检测到菌株SX3411发酵液对猪链球菌(Streptococcus suis)、枯草芽孢杆菌(非本筛选菌株)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和嗜水性单胞杆菌(Aeromonas hydrophila)具有抑菌作用。通过基因簇克隆和测序,表明其中抑菌物质主要为羊毛硫细菌素subtilomycin。理化特性分析表明菌株SX3411发酵液中抑菌物质具耐热和耐酸碱特性。SDS-PAGE检测表明subtilomycin分子质量在4 kDa左右。模拟胃液对subtilomycin抑菌活性影响不大,但不耐蛋白酶K和模拟肠液的处理。该研究为进一步开发应用羊毛硫细菌素subtilomycin奠定了基础。

枯草芽孢杆菌SX3411羊毛硫细菌素Subtilomycin结构基因subA的原核中串联表达和抗体制备

为了提高枯草芽孢杆菌SX3411菌株羊毛硫细菌素Subtilomycin前体基因subA表达产物的抗原性,采用化学合成的方法合成了SubA的3次重复串联体3×subA基因,构建了该基因的原核表达载体并转入大肠杆菌中。结果表明,3×subA基因在大肠杆菌中获得了融合表达。利用SDS-PAGE纯化大肠杆菌中融合表达的3×SubA,免疫家兔后制备抗体anti-3×SubA,该抗体经检测有较高的滴度。通过Western Blotting杂交,检测了Subtilomycin前体多肽SubA的胞内表达特性。结果表明,枯草芽孢杆菌SX3411在30℃培养的条件下进行不同时间取样检测,枯草芽孢杆菌3411约在培养的第10,12小时胞内有较多的SubA表达。综上所述,通过串联表达Subtilomycin前体基因subA所获得的融合表达产物3×SubA具有较好的抗原性,以此获得的抗体anti-3×SubA完全可以用于枯草芽孢杆菌SX3411中Subtilomycin前体检测和分析。

羊毛硫细菌素bovicin HJ50修饰酶BovM双功能域单独催化活性鉴定

【目的】体外重建羊毛硫细菌素bovicin HJ50修饰酶Bov M双功能域(脱水酶与环化酶功能域)各自的催化活性,为深入了解Bov M催化机制奠定基础。【方法】在大肠杆菌(Escherichia coli)中分别异源表达纯化Bov M含脱水功能域的N端与含环化功能域的C端重组蛋白,构建体外反应体系,分别对其前肽底物Bov A进行修饰,通过产物抑菌活性及MALDI-TOF MS分子量检测来鉴定两者的修饰活性;并通过体内体外两种方法检测双功能域蛋白之间的协同作用。【结果】Bov M的N端脱水功能域及C端环化功能域分别具有脱水与环化活性,但双功能域重组蛋白之间没有协同作用。【结论】Bov M双功能域均可独立行使各自的催化功能,但Bov M的完整结构对其正常的催化活性非常重要。

羊毛硫细菌素变体及其生物活性研究进展

羊毛硫细菌素是由细菌核糖体上合成并经翻译后加工修饰而成的一类抗菌肽。已经在多种G+细菌中发现有羊毛硫细菌素,大多对G+细菌有抑菌作用。羊毛硫细菌素的基因工程无法从单一的表达羊毛硫细菌素结构基因获得高活性的成熟羊毛硫细菌素。本研究综述了羊毛硫细菌素前体分子定向位点突变后,由修饰酶重新识别和修饰可产生结构变异的可分泌的变体分子和无法分泌的变体分子,对羊毛硫细菌素分子突变位点进行了分类和归纳,并总结了羊毛硫细菌素分子突变位点与其生物活性的关系。在现有羊毛硫细菌素应用成果有限的条件下,对于工程改造羊毛硫细菌素和增强其抑菌活性具有重要意义。

前导肽切割位点对Ⅱ类羊毛硫细菌素切割酶活性的影响

【背景】Ⅱ类羊毛硫细菌素大多是由革兰氏阳性菌的核糖体合成并经过翻译后修饰产生的小肽,其生物合成的最后一步是由转运蛋白LanTN端的肽酶结构域对前导肽进行切割,释放出有活性的羊毛硫细菌素,但目前关于该类羊毛硫细菌素前导肽的切割机制尚不清楚。【目的】考察前导肽切割位点对不同链球菌来源的肽酶结构域BovT150和SboT150酶切活性的影响。【方法】运用不依赖连接酶的定点突变技术构建前导肽切割位点突变的前体蛋白表达载体,在大肠杆菌(Escherichia coli)中分别表达纯化野生型前体(Bov Am和Sbo Am)、突变型前体及对应的切割酶(Bov T150和Sbo T150),构建体外酶切体系,利用HPLC、抑菌活性分析和MALDI-TOF MS检测前导肽的切除情况。【结果】BovT150不仅能够切割Bov Am的GG和GA位点,也能切割Sbo Am的GG和GA位点,并且对切割位点为Gly的前体切割活性较高;Sbo T150仅能切割Sbo Am的GG和GA位点,而对切割位点为Ala的活性较高。【结论】II类羊毛硫细菌素前导肽切割位点氨基酸残基的改变不同程度地影响切割酶的切割效率。

猪链球菌细菌素的筛选及理化特性分析

为研究猪链球菌(SS)产生的细菌素,本研究以不同省份分离到的200株SS为研究对象,采用琼脂扩散法筛选具有抑菌作用的菌株;通过CGE网站进行ST型分型,利用PCR方法进行血清型分型;选出的菌株利用PCR方法检测细菌素相关基因;然后用BAGEL4对细菌素相关基因进行全序列基因功能分析,同时采用PCR分段扩增其基因簇;并分析SS所产细菌素的理化特性。结果显示,从200株SS中筛选出了21株可产生抑菌物质的SS,它们分布于不同的ST型和血清型。其中菌株xj-144和38-3携带SS细菌素编码基因sss基因和suiA基因,经BAGEL4分析菌株xj-144仅存在一个与suicin 65核心肽相同的细菌素,并无其他潜在细菌素,其完整的基因簇含有10个ORFs,产生的细菌素排除有机酸、过氧化氢干扰后,其粗提取液具有一定的耐热性、酸碱耐受性和蛋白酶稳定性,并对部分病原菌具有抑菌作用。本研究为进一步研究SS细菌素奠定了一定的基础,为实现细菌素替代传统抗生素提供了科学参考。

乳链菌肽——从实验室走进百姓生活

乳链菌肽(Nisin)是乳酸菌产生的一种含特殊氨基酸的羊毛硫细菌素,因其高抑菌活性及安全性,可用作天然食品防腐剂。20世纪80年代末,中国科学院微生物研究所率先在国内开展了对乳链菌肽的研究和开发工作。从菌种选育、发酵及后提取工艺优化、到技术转移转化,经过几代科学家的不断创新与自主研发,产学研成功结合,乳链菌肽最终从实验室走向了工业化生产,走向了市场,走进了寻常百姓家,为"微生物,高科技,大产业"做了很好的诠释。

前导肽二级结构对bovicin HJ50修饰和加工的影响

【目的】阐明羊毛硫细菌素bovicin HJ50前导肽的二级结构对原肽修饰和加工的影响规律。【方法】采用半体外生物合成系统构建bovicin HJ50前导肽突变体,然后利用MALDI-TOF质谱鉴定成熟肽的修饰情况。同时,结合HPLC和抑菌活性分析其对成熟肽加工效率的影响。【结果】我们构建了6个bovicin HJ50前导肽二级结构相关的突变体(F-16A,V-15E,E-14L,E-8P,L-7D,L-4K)。F-16A,V-15E,L-4K几乎不影响修饰和加工;E-14L和E-8P的修饰则发生了变化;另发现L-7D导致加工过程受到强烈抑制。【结论】Bovicin HJ50前导序列中保守的螺旋结构区对修饰酶BovM和蛋白酶BovT150活性都有不同程度影响,其二级结构的维持对bovicin HJ50的修饰和加工具有重要作用。