肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体修饰的人羊水间充质干细胞

背景:以间充质干细胞为载体的基因治疗新方法具有广阔的应用价值。目的:利用慢病毒感染方法将肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体导入人羊水来源的间充质干细胞,以期获得稳定表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的人羊水间充质干细胞。方法:首先利用多位点Gateway技术构建慢病毒表达载体pLVpuro/EF1α-肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体,将该表达载体与慢病毒包装质粒同时转染293FT细胞,从而获得携带肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒颗粒。利用重组慢病毒颗粒感染人羊水间充质干细胞,并通过抗生素筛选的方法获得稳定表达目的基因-肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的羊水间充质干细胞,并对其稳定性进行鉴定。结果与结论:酶联免疫吸附法和Westernblot检测结果表明,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在感染的人羊水间充质干细胞内呈高表达,其表达量可达到72μg/L。说明实验成功制备了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体修饰的人羊水间充质干细胞。

超低温冻存对人羊水间充质干细胞生物学特性的影响

目的观察超低温冻存对人羊水间充质干细胞(AF-MSC)生物学特性的影响。方法通过羊膜腔穿刺取得人孕16～23周羊水,分离培养出人AF-MSC。将第4代人AF-MSC经短期超低温冻存、复苏后,通过细胞活性率测定、形态学比较、细胞增殖功能测定、细胞周期分析及细胞表面抗原检测,观察超低温冻存对人AF-MSC生物学特性的影响。结果第4代人AF-MSC冻存、复苏前后的两组细胞无论在细胞活性率、细胞形态、细胞增殖能力、细胞周期、细胞表面抗原的表达等方面均无显著性差异(P>0.05)。结论短期的超低温冻存对人AF-MSC的生物活性无明显影响。

Matrigel对羊水间充质干细胞成组织能力的影响

目的研究Matrigel对羊水间充质干细胞在裸鼠皮下成组织能力的影响。方法将羊水间充质干细胞与Matrigel混合,注入裸鼠皮下,14d后观察新生物的形态外观和组织结构。并以不混合Matrigel的羊水间充质干细胞注入裸鼠皮下作为阴性对照,单纯Matrigel注入裸鼠皮下作为空白对照。结果实验组和阴性对照组在裸鼠皮下均形成一长圆形瘤样组织,其形态外观基本一致,但组织结构有明显差异,在实验组组织血供丰富,主要为腺样结构,部分含管腔,向平滑肌细胞,上皮细胞和幼稚神经细胞分化。在阴性对照组血供较少,细胞呈单一平铺排列,未观察到明显组织结构,细胞未分化。空白对照组无新生组织形成。结论Matrigel能促使羊水间充质干细胞在裸鼠皮下向成熟的组织细胞分化并形成简单的腺样组织结构。

牛羊水间充质干细胞对小鼠酒精性肝病的影响

试验旨在分离培养牛羊水间充质干细胞(AF-MSCs),并研究其对酒精性肝病(ALD)小鼠治疗效果以及对肝组织中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)及Toll样受体4(TLR4)mRNA表达的影响。从4~5月龄雌性胎牛羊水中获取AF-MSCs,进行RT-PCR、免疫荧光及诱导成脂鉴定。将48只ICR小鼠(雄性)随机分为4组:空白对照组(BC组)、模型对照组(MC组)、AF-MSCs组(MC+AF-MSCs组)和水飞蓟宾胶囊(SC)组(MC+SC组),每组12只。除BC组灌胃0.2 mL生理盐水,其余各组均灌胃56度红星二锅头(5 g·kg^(-1),2次·d^(-1)),连续4周;第29天MC+AF-MSCs组进行肝外注射Dil标记的AF-MSCs(5×106个·mL^(-1)),MC+SC组分2次灌胃SC 2.4 mg(溶于56度红星二锅头);试验结束后,测定小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和甘油三酯(TG)活性。HE染色、免疫组化法观察造模情况,Dil示踪AF-MSCs在肝内定植分布;qRT-PCR法检测HIF-1α、VEGF及TLR4基因表达情况。RT-PCR、免疫荧光结果表明,分离得到牛AF-MSCs,且有诱导成脂分化能力。血清学结果显示,MC组ALT、AST和TG活性极显著高于BC组(P<0.01)。组织病理切片显示,MC组肝组织中出现脂肪性变、炎性细胞浸润及肝血窦充血等病理性变化,说明56度红星二锅头成功复制ALD小鼠模型;与MC+SC组相比,MC+AF-MSCs组ALT、AST活性显著降低(P<0.01),肝组织中脂肪性变减轻,肝血窦未见充血,说明AF-MSCs对肝功能的改善比SC效果显著;qRT-PCR结果显示,MC+AF-MSCs组下调HIF-1α、VEGF、TLR4基因的表达量较MC+SC组显著(P<0.01),说明AF-MSCs参与HIF-1α/VEGF信号通路的调控,抑制TLR4表达的效果优于SC;细胞示踪术证明,AF-MSCs定植在病变部位并趋化更多AF-MSCs向炎症部位迁移参与肝组织的修复。综上,本研究成功分离得到牛AF-MSCs,其能够参与调节氧化应激、血管生成及抑制炎性因子的释放,且改善ALD的效果优于SC。

羊水间充质干细胞在肿瘤治疗中的研究进展

羊水间充质干细胞是多能的非造血祖细胞，具有自我修复及多向分化潜能，如成骨细胞、成软骨细胞及成脂肪细胞。尽管其具有高度增殖能力，但是其在体内并没有成瘤的报道，甚至多次传代后其核型也正常。 AF-MSCs对肿瘤的趋向性及其作为治疗多种肿瘤的细胞载体已经被很多研究证实。本文总结近期国内外的相关文献，就羊水间充质干细胞在肿瘤治疗中的研究进展进行综述。

干扰素β和γ基因修饰的人羊水间充质干细胞的制备

目的利用慢病毒转染的方法将人干扰素β基因(hIFN-β)、人干扰素γ基因(hIFN-γ)分别导入人羊水来源的间充质干细胞(AFMSCs),以期获得稳定表达hIFN-β、hIFN-γ的AFMSCs。方法产前诊断获得羊水标本,培养出AFMSCs,对其增殖能力、细胞表面分子和体外分化能力进行鉴定。用携带hIFN-β、hIFN-γ基因的重组慢病毒颗粒感染AFMSCs,并用Elisa法对培养基上清中hIFN-β、hIFN-γ的分泌情况进行鉴定。结果人羊水间充质干细胞呈成纤维样形态,不表达CD34,高表达CD44、CD105和HLA-ABC,能稳定传代培养,具有成骨、成脂分化能力。ELISA结果显示hIFN-β、hIFN-γ修饰的AFMSCs能稳定表达hIFN-β、hIFN-γ,其表达量分别达1 830 pg/m L和65.33 pg/m L。结论利用慢病毒转染的方法成功制备了hIFN-β、hIFN-γ修饰的人羊水间充质干细胞。

人羊水间充质干细胞对膜性肾病大鼠的治疗作用

目的研究人羊水间充质干细胞(AF-MSC)对膜性肾病大鼠的治疗作用。方法24只健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组(Control组)、模型组(Model组)和AF-MSC治疗组(AF-MSC组),每组8只。在模型组和AF-MSC组注射羊抗大鼠Fx1A抗体构建膜性肾病大鼠模型。造模成功后连续4周尾静脉注射AF-MSC;每周检测大鼠尿蛋白/肌酐比值(UPCR);治疗结束后,腹主动脉取血检测血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、白蛋白(Alb)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC);肾脏组织切片经马松(Masson)和过碘酸-六胺银(PASM)染色,光镜下观察病理变化;透射电镜观察足细胞和基底膜结构变化;免疫荧光测定各组肾脏组织中IgG、膜攻击复合物C5b-9表达。免疫组织化学观测足细胞nephrin、podocin表达。结果与模型组相比,AF-MSC治疗组UPCR在第4周时显著下降(P<0.01)。血清白蛋白升高和胆固醇下降(均P<0.05);病理结果显示肾小球基底膜免疫复合物沉积减少,基底膜增厚程度减少,足细胞形态相对完好;免疫荧光结果显示IgG和C5b-9沉积减弱;免疫组化结果显示AF-MSC组足细胞中nephrin及podocin蛋白表达增强(P<0.01)。结论AF-MSC可以明显改善膜性肾病大鼠的肾脏损伤。

人羊水间充质干细胞对乙型肝炎肝衰竭患者外周血Th1／Th2的体外调节

目的探讨人羊水间充质干细胞（human amniotie fluid—derived mesenchymal stem cells，h-AFMsc）对乙型肝炎肝衰竭患者外周血Th1／Th2的体外调节作用。方法选择2011年2—5月中山大学附属第三医院6例乙型肝炎肝衰竭患者和6名健康志愿者，提取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuelear cells，PBMC），同时从孕妇中期羊水中提取h-AFMSC。将h-AFMSC分别与乙型肝炎肝衰竭患者和健康捐献者的PBMC共培养72h，乙型肝炎肝衰竭患者和健康捐献者的PBMC单独培养组作为对照。应用流式细胞仪检测共培养前后不同组PBMCIFNγ（Th1）和IL-4（Th2）的变化情况，计算Th1／Th2比值。对共培养前后数据进行Mauchly球形检验，P〉0．1满足球形假设检验则采用重复测量方差分析。结果共培养72h，乙型肝炎肝衰竭患者PBMC与h—AFMSC共培养组的Th1细胞比例与其PBMC单独培养组比较无明显差异（F=0．82，P〉0．05），但Th2细胞比例明显下降（F=10．24，P〈0．05），从而导致Th1／Th2比值显著上升（F=17．28，P〈0．01）。健康捐献者PBMC与h-AFMSC共培养组的Th1、Th2和Th1／Th2比值与其PBMC单独培养组比较差异均不明显（F值分别为0．54、0．68和0．74，P值均〉0．05）。结论h-AFMSC对乙型肝炎肝衰竭患者的Th1／Th2有体外调节作用，具有作为移植种子来源移植治疗乙型肝炎肝衰竭的可能性。

人羊水间充质干细胞治疗肿瘤的临床研究进展

人羊水间充质干细胞(Human amniotic fluid derived mesenchymal stem cells,AF-MSCs)是一类具有高度增殖、自我更新和多项分化潜能的干细胞,即使经过多次传代其生物学特性也不会发生改变。有研究表明,AF-MSCs具有免疫原性低、不成瘤性和肿瘤细胞亲嗜性等特点,而且能够迁移到肿瘤病灶。因此,AF-MSCs作为转运载体介导药物靶向治疗肿瘤具有潜在的优势。同时,通过羊膜腔穿刺获得羊水有利于避免胚胎干细胞研究有关的伦理问题,可作为一种理想的治疗方法。本文通过回顾、总结人羊水间充质干细胞的研究进展,展望人羊水间充质干细胞治疗肿瘤的应用前景。

人羊水间充质干细胞的分离鉴定及其对抗Thy-1肾炎的治疗作用

探讨羊水间充质干细胞(amniotic fluid mesenchymal stem cells,AF-MSCs)对抗Thy-1肾炎模型的治疗作用。方法采用差异性贴壁与机械性分离法从人孕中期羊水中分离出羊水间充质干细胞,流式细胞术鉴定其表面标志物,成脂、成骨诱导分化检测其分化能力。利用尾静脉注射抗Thy-1抗体建立SD大鼠抗Thy-1系膜增生性肾炎模型;将第5代羊水间充质干细胞通过尾静脉注射治疗抗Thy-1系膜增生性肾炎大鼠,检测大鼠尿蛋白的变化,PAS染色观察大鼠肾脏病理改变。结果羊水间充质干细胞顺利分离,流式结果显示其表达间充质干细胞标志物(CD29、CD44、CD73、CD90、CD105)和胚胎干细胞标志物(SSEA-4)而不表达造血干细胞标志物(CD34、CD45、CD133),且在适当条件下能够被诱导分化为脂肪细胞和骨细胞。羊水间充质干细胞治疗后,与模型组相比,治疗组在第7、12天时24 h尿蛋白明显下降(P<0.01),且肾脏病理结果表明系膜细胞增殖减轻,系膜区细胞外基质积聚减少。结论成功的从人孕中期羊水中分离出羊水间充质干细胞,羊水间充质干细胞治疗系膜增生性肾小球肾炎有效。

人羊水、脐带、胎盘来源间充质干细胞体外增殖、分化、运输和免疫学特性的比较

背景:随着再生医学推进,干细胞在疾病治疗中的使用频率逐步增高。目前在临床使用中,细胞数量、分化能力、异体接种时产生免疫排斥的可能性等因素都需要考虑,因此筛选出更适合临床使用的细胞种类显得十分有意义。目的:比较人羊水、脐带、胎盘来源间充质干细胞的体外增殖能力、分化能力、运输液中细胞活性、免疫学特性,为临床应用提供选择依据。方法:分别对3种细胞进行分离培养和免疫荧光鉴定,在体外诱导3种细胞成骨、成脂、成神经分化;q PCR检测成神经分化后的Nestin、NT-3、MANF表达量;流式细胞术定量分析HLA-ABC、HLA-DR的表达量;将3种细胞放于细胞运输液内常温放置24,48,72 h,计算活细胞数量。结果与结论:(1)脐带间充质干细胞成脂能力最强,胎盘间充质干细胞成骨能力最好,3种细胞均可以表达神经细胞标志Nestin和GFAP;(2)成神经诱导后的胎盘间充质干细胞高表达NT-3,脐带间充质干细胞高表达MANF,分别可以用于不同类型的神经损伤修复;(3)羊水干细胞低表达HLA-ABC,不表达HLA-DR,更适合异体接种,产生免疫排斥的可能最低;(4)细胞运输液内储存72 h后羊水干细胞的存活率最高;(5)由于羊水、胎盘、脐带间充质干细胞在生物学特性上稍有差异,因此可根据其特点用于不同临床疾病治疗。

羊水间充质干细胞研究进展及临床应用

羊水间充质干细胞(amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells,AFMSCs)是一类具有自我更新复制和多项分化潜能的成体干细胞。其增殖分化能力强,免疫原性低,不成瘤性及肿瘤细胞的亲嗜性等生物学特性使其成为组织工程良好的种子细胞和抗肿瘤药物良好的靶向运载体用于器官组织形态功能的恢复和肿瘤性疾病的治疗,并且取得了显著的疗效,预示其强大的临床应用前景。

不同胚层来源成体干细胞修复周围神经损伤

背景:成体干细胞疗法是周围神经损伤修复与再生领域的研究热点之一。中胚层被视为成体干细胞的理想来源,间充质干细胞具有获得率高、来源广、增殖快等优异性能。而外胚层来源成体干细胞,尤其是神经嵴干细胞,具有神经源性,越来越受到研究人员的关注。目的:对来自外胚层和中胚层的多功能成体干细胞在周围神经损伤修复与再生中的作用及机制进行简要综述,探究不同来源成体干细胞的研究进展与应用前景,并结合临床研究,探讨成体干细胞疗法潜在的应用价值以及亟待解决的问题。方法:第一作者于2024年2月应用计算机在PubMed和SinoMed数据库检索2001年12月至2024年2月相关文献,以“ectodermal stem cells,mesenchymal stem cells,peripheral nerve injury,repair,regeneration”为英文检索词,以“外胚层干细胞、间充质干细胞、周围神经损伤、修复、再生”为中文检索词,最终纳入69篇文献进行分析论述。结果与结论:①外胚层来源成体干细胞具有优异的分化和再生潜能,尤其是毛囊神经嵴干细胞、嗅干细胞、牙外胚层干细胞等,具有神经源性,可在体外表达神经特异性标志物,但目前缺少临床试验研究。②中胚层来源成体干细胞种类多、易获得及纯化,其中骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞在周围神经损伤修复的应用疗效及安全性方面有相关临床试验支持,能改善感觉及运动神经传导,且在随访中未出现并发症和明显不良反应。骨髓间充质干细胞的获取需行侵入性外科手术且要求患者与捐赠者骨髓配型吻合,应用受到一定限制;而脐带间充质干细胞虽无需侵入性获取,但分离较困难且表型不稳定。③内胚层来源成体干细胞常难以在体外生长,应用受限,目前应用于临床的可能性低。④综合来看,骨髓间充质干细胞仍为周围神经损伤干细胞治疗的首选细胞,适用于无外科手术禁忌且符合配型要求的情况,其次为脐带间充质干细胞,辅以分离方法的改进和表型稳定性的提高策略。⑤牙外胚层干细胞以及脂肪间充质干细胞具有较高应用潜能,有待进一步临床试验,其他外胚层、中胚层来源成体干细胞各以其优异特性在动物及细胞实验研究中具有显著优势。

不同来源间充质干细胞条件培养基对内源性衰老细胞作用的比较

背景:随着经济的发展,人们对美的追求越来越高,抗衰老研究成为当今的研究热点。干细胞是具有自我更新能力和多向分化能力的细胞,间充质干细胞是其中的一种。研究表明间充质干细胞能通过旁分泌作用修复损伤衰老的细胞,但对于不同来源间充质干细胞条件培养基的抗皮肤衰老作用研究甚少。目的:比较人脂肪、羊水、胎盘、脐带来源间充质干细胞条件培养基对自然衰老皮肤成纤维细胞的抗衰老作用。方法:制备人脂肪、羊水、胎盘、脐带4种不同来源的间充质干细胞条件培养基,添加到自然衰老皮肤成纤维细胞中,采用CCK-8法检测细胞活力、β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞衰老率、DCFH-DA探针检测活性氧含量以及q PCR检测p16、p53、COL1、KLOTHO基因表达量。结果与结论:①4种间充质干细胞条件培养基均能提高皮肤成纤维细胞的活力,其中脂肪间充质干细胞条件培养基的效果最好,β-半乳糖苷酶染色率最低;②4种间充质干细胞条件培养基均能降低活性氧含量,脂肪和羊水来源间充质干细胞条件培养基组的活性氧含量最低;③p16和p53在胎盘和脐带间充质干细胞条件培养基组的表达均高于对照组,在羊水来源间充质干细胞条件培养基组的表达较低,脂肪间充质干细胞条件培养基组p16表达显著低于对照组,但p53的表达较高;④COL1基因表达除羊水间充质干细胞条件培养基组外,其他3组均显著高于对照组,KLOTHO基因表达除胎盘间充质干细胞条件培养基组外,其他3组均显著高于对照组,且脂肪间充质干细胞条件培养基组的表达最高;⑤结果显示,4种不同来源间充质干细胞条件培养基能在一定程度上延缓细胞衰老,但作用效果存在差异,其作用机制还有待进一步研究。

三种不同来源的围产期间充质干细胞条件培养基的抗癌能力比较

目的:探究羊水、脐带和胎盘三种不同来源间充质干细胞中,抑癌效果最好的间充质条件培养基。方法:应用羊水、脐带和胎盘三种不同来源间充质干细胞的不同浓度的条件培养基分别培养HELA、SKOV-3、MCF-7三种癌细胞,CCK-8法检测培养72 h后不同癌细胞的细胞活性;应用羊水、脐带和胎盘三种不同来源间充质干细胞条件培养基培养HELA细胞24、48、72、96 h后,利用CCK-8法检测癌细胞的细胞活性;采用Annexin V-FITC/PI通过流式细胞术检测条件培养基培养HELA细胞72 h后的癌细胞凋亡情况;qPCR鉴定条件培养基培养HELA细胞72 h后的癌症相关基因LOXL2、LIF、CatB、FOXQ1的表达,同时对不同间充质干细胞条件培养基培养后迁移的HELA细胞数量进行计算。结果:三种不同浓度的条件培养基均对癌细胞有抑制作用,其中浓度为100%条件培养基对癌细胞的抑制作用最好;三种不同来源间充质干细胞条件培养基均对癌细胞有抑制作用,且羊水间充质干细胞条件培养基培养HELA细胞72 h对癌细胞的抑制作用最强;流式细胞术与qPCR结果表明间充质干细胞条件培养基抑制HELA细胞生长的作用机制是通过促进其凋亡进行的;羊水间充质干细胞条件培养基培养后HELA细胞迁移数量最少。结论:羊水间充质干细胞是最适合用于抑制癌细胞生长的细胞,可以促进癌细胞凋亡,浓度为100%条件培养基培养癌细胞72 h对癌细胞抑制效果最好。

人羊水来源间充质干细胞冻存后生物学特征研究

目的体外分离培养人羊水间充质干细胞(human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells,HAFMSCs),观察低温冻存复苏后HAFMSCs生物学特征,为进一步研究奠定理论基础。方法取12份自愿捐赠的孕16～20周羊水标本,采用改良两步法分离培养HAFMSCs,用含量不同的FBS、DMSO冻存液冻存细胞,液氮冻存12周后42℃水浴复苏,锥虫蓝染色检测细胞存活率,MTT法检测细胞增殖速度并绘制生长曲线,流式细胞仪检测冻存复苏后HAFMSCs表型。对冻存复苏后的HAFMSCs进行成脂、成骨诱导分化培养,并分别采用油红O、von Kossa染色进行鉴定;实时荧光定量PCR分析细胞冻存前后Oct-4、Nanog mRNA表达差异。结果细胞冻存12周后,不同的冻存方案对细胞存活率影响有差异,优化的冻存方案为DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%。冻存复苏后的HAFMSCs呈漩涡状排列,生长曲线呈S形,与冻存前细胞生长曲线相似。流式细胞仪检测示冻存复苏后细胞的MSCs表型CD29、CD44、CD73、CD90为阳性,造血干细胞表型CD34、CD45为阴性。成脂、成骨诱导21 d,油红O、von Kossa染色均呈阳性。实时荧光定量PCR检测示冻存前后Oct-4、Nanog mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HAFMSCs具有体外增殖快、分化能力强的优势;并可耐受短期冻存,复苏后细胞存活率高,生物学特征及分化潜能未发生明显变化,冻存液DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%是较好冻存方案。

人羊水来源c-kit^+间充质干细胞的生物学特征和心肌诱导分化

目的探讨人羊水来源c-kit^+间充质干细胞(c-kit^+human amniotic fluid-derived mesenchymal stemcells,c-kit^+HAFMSCs)的生物学特征及心肌诱导分化能力。方法通过产前诊断或自愿引产获取50份孕中期羊水标本,经流式细胞仪分选c-kit^+HAFMSCs,MTT法观察细胞增殖情况,并通过流式细胞仪、细胞免疫化学染色观察行细胞表型鉴定。在体外经成骨及成脂诱导分化,于诱导培养后21 d采用yon Kossa染色观察钙沉积颗粒,油红O染色观察脂滴形成情况。实时荧光定量PCR检测细胞经5氮-2'脱氧胞苷心肌诱导前后,NKx2.5、Tbx5、GATA-4、α-MHC 4种心肌特异性基因表达情况。结果经流式细胞仪分选,人孕中期羊水中c-kit^+HAFMSCs含量约为贴壁细胞的3.07%±1.03%;体外增殖迅速,表达MSCs表面标志CD29、CD44、CD73、CD90、CD105,不表达造血干细胞表面标志CD34、CD45;农达人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-ABC,不表达HLA-DR。细胞免疫化学染色示CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Oct-4染色呈阳性,CD34、CD45染色呈阴性。MTT检测示第5、10、15代c-kit^+HAFMSCs具有相似的生长曲线。成骨和成脂诱导培养后21 d,细胞内有钙盐沉积和脂滴形成。实时荧光定量PCR检测示,心肌诱导后14 d,NKx2.5、Tbx5、GATA-4、α-MHC 4种心肌特异性基因表达均较诱导前明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论通过流式细胞仪分选的c-kit^+HAFMSCs在体外可以诱导分化为心肌样细胞,可能成为心肌再生性治疗的种子细胞。