羊瘙痒因子263K经颅内注射感染仓鼠后半数致死量(LD_(50))的测定

目的测定羊瘙痒因子263K经颅内注射感染仓鼠后的LD50。方法将感染羊瘙痒因子263K的仓鼠脑组织用生理盐水制成10%(w/v)脑组织匀浆,梯度稀释后感染仓鼠,观察仓鼠的发病情况。以Reed-Muench公式计算LD50,用West-ern blot方法检测观察期结束后发病及仍存活的仓鼠脑组织、脾组织中抵抗蛋白酶K的PrPSc。结果当颅内接种稀释度由低到高变化时,仓鼠发病的潜伏期及病程同时也由短到长发生变化。发病仓鼠脑组织中可以检测到PrPSc,但是PrPSc的量在不同的组之间无太大差别。观察期结束后,仍存活的仓鼠脑组织中未检测到具有PK抗性的PrP信号。结论本实验室保存的羊瘙痒因子263K经颅内注射感染仓鼠的LD50为9.2-log10LD50i.c.units/0.001g brain,即当对仓鼠颅内接种10μl羊瘙痒因子263K的10-9.2稀释液时,50%的仓鼠会死亡。

羊瘙痒因子263K感染的金黄仓鼠脑中PrP^(Sc)的动态沉积特点

目的 观察羊瘙痒因子 2 63K感染的金黄仓鼠脑中PrPSc的沉积特点。方法 颅内接种羊瘙痒因子 2 63K感染金黄仓鼠 ,分别于接种后第 2 0天、40天、50天、60天和 70天取脑组织 ,用免疫组化法检测PrPSc的沉积 ,HE染色观察病理变化 ,Westernblot检测蛋白酶抗性PrPSc。结果 颅内接种 2 63K后第 2 0天 ,脑组织中即可检测到耐热和耐蛋白酶K的PrPSc的沉积 ,呈散在分布 ;第 40天可见细胞内PrPSc的沉积 ,第 50天脑组织中出现灶性、颗粒状、细胞内PrPSc的沉积 ,累及部位扩大 ,第60 - 70天可见弥漫性呈桑葚状、斑块状沉积物。PrPSc主要沉积于大脑皮质Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ层 ,海马锥体细胞层 ,小脑皮质颗粒层。HE染色结果显示大脑皮质海绵样病变在接种后 40天出现 ,随着接种时间的延长而加剧。Westernblot检测显示PrPSc在接种后 40天即可检出 ,PrP总量和PrPSc含量随着接种时间的延长而增加。结论 随着接种时间延长 ,羊瘙痒因子 2 63K感染的金黄仓鼠脑中PrPSc沉积累及的范围、程度扩大 ,IHC检测脑组织中PrPSc的沉积早于临床症状的出现 ,甚至其它检测方法的检出。

羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织CaM信号通路变化的研究

为了探究朊病毒感染中钙调蛋白信号通路的变化情况,对羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织中钙调蛋白的表达变化、分布特点及下游相关激酶及调控蛋白的表达变化情况进行了检测。结果显示在羊瘙痒因子263K感染仓鼠终末期脑组织中钙调蛋白的表达水平较正常仓鼠明显上调。钙调蛋白下游相关激酶及它们的磷酸化形式均明显下调,同时Ca MKs的下游调控蛋白——CREB也呈下调趋势,而靶蛋白——BDNF的表达则明显受到抑制。研究提示在朊病毒感染中很可能存在某种原因影响了钙调蛋白的功能。

CXCL1/CXCR2在羊瘙痒因子感染小鼠脑组织中的分布特征研究

目的探究朊病毒感染小鼠脑组织CXC趋化因子配体1(CXCL1)与CXC趋化因子受体2(CXCR2)的分布特征。方法通过免疫组织化学、免疫组织荧光双染实验明确羊瘙痒因子139A及ME7感染终末期小鼠脑组织中CXCL1/CXCR2的分布特征,确定CXCL1/CXCR2的靶细胞及与羊瘙痒因子样朊蛋白(PrPSc)沉积的关系。结果通过全脑区免疫组化染色发现,CXCL1/CXCR2在羊瘙痒因子139A及ME7感染终末期小鼠脑组织中的含量明显升高,主要分布在海马、皮层、丘脑、小脑及延髓5个脑区。CXCL1与小胶质细胞和神经元细胞存在共定位,而CXCR2与神经元细胞存在共定位。在羊瘙痒因子139A及ME7感染终末期小鼠脑组织中CXCL1、CXCR2和PrPSc三者存在明显共定位。结论CXCL1/CXCR2分布于朊病毒感染小鼠脑组织中朊病毒病理特征集中的脑区。

感染羊瘙痒因子263K株或139A株仓鼠脑组织中tau蛋白和磷酸化tau蛋白变化的研究

为探讨朊病毒病的神经病理特征,应用Western blot方法检测了感染羊瘙痒因子263K株或139A株的仓鼠脑组织中总tau蛋白和Ser396和Ser404位点发生磷酸化tau蛋白表达水平的变化;并应用Real Time PCR方法检测了tau mRNAs转录活性的改变。结果表明总tau蛋白含量升高而Ser396和Ser404位点发生磷酸化的tau蛋白含量降低,该现象与羊瘙痒因子毒株类型和临床潜伏期无关;感染羊瘙痒因子的仓鼠脑组织中Tau2和Tau4这两个异构体的转录水平升高。这些结果表明tau蛋白在Ser396和Ser404位点的去磷酸化可能与朊病毒病发病相关。

核转录因子-κB(p65)在羊瘙痒因子139A感染小鼠脑组织中变化的研究

目的研究NF-κB(p65)在羊瘙痒因子139A感染小鼠脑组织中的变化。方法通过蛋白质免疫印迹法及免疫组织化学的方法检测p65在139A感染的脑组织均浆中的含量变化。利用免疫荧光方法检测p65在神经元及胶质细胞中的分布情况。结果在139A感染终末期小鼠脑组织均浆中,p65含量下降,差异有统计学意义。对感染不同时间点的动态分析结果显示,p65含量呈先升高随后逐渐降低趋势。免疫组织化学显示,139A感染终末期小鼠大脑皮层p65含量明显下降。免疫组织荧光显示在正常和139A感染终末期小鼠脑组织中,p65与神经元细胞存在共定位现象。结论 NF-κB(p65)在小鼠中枢神经系统中主要分布于神经元细胞,在139A感染的小鼠终末期脑组织中,p65总量明显下降,提示在139A感染的小鼠脑组织中,NF-κB(p65)出现了变化,在疾病进程中发挥一定作用。

羊瘙痒因子感染小鼠脑组织中MicroRNA—375对PDK1蛋白表达调控研究

目的 研究羊瘙痒因子139 A感染小鼠脑组织中3＇磷酸肌醇依赖的激酶1（3＇-phosphoinositide-dependert kinase 1,PDK1）和micro RNA-375（miR-375）含量的变化;探讨miR-375在朊病毒病发生发展过程中对PDK1蛋白表达的影响.方法 以羊瘙痒因子139 A感染的终末期小鼠脑组织为研究对象,通过Western blot方法检测脑组织中PDK1蛋白的含量;采用RT-PCR和二代测序的方法检测脑组织中miR-375含量的变化;利用了PmiR-REPORT报道系统检测miR-375对PDK1 3＇UTR调控的影响.结果 PDK1在羊瘙痒因子139 A感染小鼠脑组织中的表达量相对于正常对照组增高6倍左右,而miR-375表达量降低（P＜0.05）;PmiR-REPORT报道系统结果表明PDK1 3＇UTR是miR-375的调控靶点.结论 在羊瘙痒因子139 A感染小鼠终末期脑组织中PDK1的含量明显增加,可能与miR-375对PDK1 3＇UTR的调控有关.

动力相关蛋白Drp1在羊瘙痒因子139A感染小鼠脑组织中变化的研究

目的研究动力相关蛋白1(Drp1)在羊瘙痒因子139A感染的小鼠脑组织中的变化。方法采用Western Blot方法检测Drp1在羊瘙痒因子139A感染的脑组织匀浆中的含量变化及其亚硝基化水平。采用组织免疫荧光方法检测Drp1在脑组织中的分布。结果在羊瘙痒因子139A感染终末期小鼠脑组织匀浆中,Drp1总量略有降低。对感染不同时间点的动态分析结果显示Drp1含量呈逐渐降低趋势,终末期稍有回升。感染终末期脑组织中亚硝基化水平明显增高。组织免疫荧光显示正常和羊瘙痒因子139A感染终末期小鼠脑组织中,Drp1与神经元细胞存在共定位现象。结论Drp1在小鼠中枢神经系统中主要分布于神经元细胞,在羊瘙痒因子139A感染的小鼠脑组织中,Drp1总量略有降低,另外亚硝基化水平明显增高,提示在羊瘙痒病感染的小鼠脑组织中,线粒体动力相关蛋白的表达量及翻译后修饰水平出现了变化,在感染过程中起着重要作用。