羊种布鲁杆菌介导的mmu-miR-149-3p靶基因的初步鉴定

布鲁杆菌病是由布氏杆菌(Brucella)引起的一种急性或慢性人兽共患传染病,在我国,羊种布鲁杆菌(Brucella melitensis,B.melitensis)最为流行。前期研究发现,mmu-miR-149-3p的潜在靶基因有10个,分别为:Bcl6b、Nos2、Slc7a11、Olr1、Ikbke、Slc31a2、IL1rl1、Dusp16、Ifit1和Rhoc。本试验通过X-treme Gene高效转染试剂,分别将5,50和100 nmol/L,Cy3标记的mimics转染至RAW264.7细胞24 h后,流式细胞仪分析,筛选出最佳转染mimics的浓度;并将mmu-miR-149-3p mimics与mmu-miR-NC mimics,按照最佳转染浓度,转染至RAW264.7细胞24 h后,加入TRIzol裂解细胞,提取总RNA,转录组获得cDNA;利用NCBI primer设计mmu-miR-149-3p的10个潜在靶基因的特异性引物,运用qRT-PCR方法,进行验证试验。结果发现,转染Cy3标记的mimics最佳浓度为100 nmol/L,其阳性率为49.94%,平均荧光强度为18.74;与mmu-miR-NC mimics转染组相比,在mmu-miR-149-3p mimics转染组中,Olr1、Slc7a11和IL1rl1的相对表达量显著降低。结果初步表明,mmu-miR-149-3p的靶基因为Olr1、Slc7a11和IL1rl1。这为揭示mmu-miR-149-3p在B.melitensis侵染巨噬细胞过程中的功能奠定了基础,还为进一步阐释B.melitensis的感染机制以及防控布病提供了参考。

羊种布鲁杆菌诱导小鼠巨噬细胞的凋亡及caspase3、8、9对细胞凋亡的调控

目的观察羊种布鲁杆菌强毒株16M和减毒株M5-90诱导小鼠巨噬细胞RAW264．7凋亡的差异性，以及半胱氨酸蛋白酶（caspase）3、8、9对细胞凋亡的调控作用。方法通过羊种布鲁杆菌16M、M5-90对小鼠巨噬细胞多重感染（细菌数：细胞数=100：1、10：1、50：1）的方式，找出最佳感染复数（MOI）。按最佳MOI=50：1建立布鲁杆菌16M、M5-90感染巨噬细胞的模型，分别在感染后2、4、8、12、24、48h后收集被感染的细胞，计数细胞内细菌菌落形成数量单位，流式细胞仪检测细胞凋亡率及caspase3、8、9对细胞凋亡的影响。结果在感染后2、4、8、12、24、48h，16M在细胞内细菌菌落形成数量分别为10^5.4、10^4.8、10^5.8、10^6.5、10^8.0、10^9.0，M5-90在细胞内细菌菌落形成数量分别为10^6.1、10^6.2、10^6.4、10^6.3、10^6.1、10^5.0，其中在感染后24、48h，强毒株16M较弱毒株M5-90在细胞内寄生菌菌落形成数量明显增加。在感染后2、4、8、12、24、48h，16M诱导的巨噬细胞凋亡率分别为（2．67±0．09）％、（13．13±0．3）％、（6．56±0．42）％、（6．49±0．28）％、（16．07±0．86）％、（24．23±1．67）％，M5-90诱导的巨噬细胞凋亡率分别为（3．62±0．02）％、（32．01±2．59）％、（17．58±0．44）％、（16．09±0．10）％、（62．53±2．70）％、（85．53±0．15）％。对照组巨噬细胞凋亡率分别为[（1.90±0．20）％、（1．92±0．16）％、（1．99±0．03）％、（2．48±0．11）％、（3．56±0．07）％、（5．26±0．33）％]，各组同时间两两比较差距均有统计学意义（P均〈0．01）。其中在感染后24-48h，弱毒株M5-90比强毒株16M更能促进巨噬细胞的凋亡。在感染后24h，对照组caspase3、8,9的表达量分别为（1．47±0．05）％、（1．52±0．02）％、（2．47±0．12）％，M5-90组caspase3、8、9的表达量分别为（9．70±0．46）％、（6．08±0．56）％、（35．08±1．64）％，caspase3、8、9的表达量与对照组相比明显增高（P均〈0．01）。在加入easpase3、8、9抑制剂后24h，对照组细胞凋亡率为（66．72±1．28）％，M5-90组caspase3、8、9的细胞凋亡率分别为（22．62±0．55）％、（53．15±1．85）％、（29．18±0．23）％，easpase3、9的细胞凋亡率与对照组相比明显降低（P均〈0．01）。结论布鲁杆菌强毒株16M和减毒株M5-90均能加速巨噬细胞凋亡，M5-90作用大于16M。在M5-90作用下，easpase3、8、9对巨噬细胞凋亡均有调控作用。

羊种布鲁氏杆菌16M对PI3K/Akt信号通路的激活

为了检测巨噬细胞内羊种布鲁氏杆菌16M（16M）对PI3K/Akt信号通路的激活,试验将16M侵染巨噬细胞应用Western-blot技术检测巨噬细胞内p-Akt（S473）和p-Akt（T308）表达变化,利用抑制剂LY294002对PI3K/Akt信号通路进行阻断,用MTT法检测抑制剂LY294002对细胞活性的影响。结果表明：16M在0.5-4 h可激活PI3K/Akt信号通路;抑制剂LY294002可阻断16M对PI3K/Akt信号通路的激活,且具有浓度依赖性;抑制剂LY294002在小于或等于20μmol/L浓度时不影响细胞活性。