羊种布鲁氏菌LpxB基因的克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析

试验旨在克隆羊种布鲁氏菌LpxB基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。以布鲁氏菌M5-90株基因组为模板,参照GenBank中M5-90株基因组DNA序列,用DNAMAN软件设计1对引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到大小为1 188bp的LpxB基因,将其连接入pMD20-T载体上,构建pMD20-T-LpxB重组质粒,将其转化到E.coli DH5α感受态细胞中,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定正确后扩大培养。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切获得的LpxB片段连接入pET-28a,构建重组质粒pET-28a-LpxB,转化到E.coli BL21(DE3)中,双酶切鉴定正确后扩大培养。经IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting对蛋白进行鉴定。运用DNAMAN、BioEdit等软件对LpxB基因编码的氨基酸序列进行分析。结果表明,本研究成功克隆了LpxB基因并进行了蛋白表达,在LpxB蛋白二级结构中,α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占52.41%、14.94%、8.10%和24.55%。

内蒙古羊种布鲁氏菌传播模式调查研究

目的调查内蒙古羊种布鲁氏菌的传播模式和流行规律。方法采用AMOS-PCR对60株布鲁氏菌的种型进行鉴定,用Hunter-Gaston Diversity Index(HGDI)评价菌株的遗传多态性特征,采用MLVA-16分型方法对菌株进行基因分型,确定菌株的亲缘关系。结果 60株试验菌全部为羊种布鲁氏菌。MLVA-16对菌株具有极高的分辨力,多态性指数为0.981;Panel 1,Panel 2A和Panel 2B的多态性指数分别为0.264,0.345和0.980;Panel 2B中Bru16位点的多态性指数最高,多态性指数为0.835。60株羊种布鲁氏菌聚为5大类37个基因型,其中15个共享基因型包括38株羊种布鲁氏菌,聚类率为63.3%(38/60),提示病例多为有流行病学关联的暴发流行;另外22株菌表现为独特基因型表明菌株无明显的流行病学相关性。共享基因型GT5包括2株分别分离自羊和骆驼的菌株且有相同的MLVA-16基因型,提示布鲁氏菌在羊和骆驼中循环传播;3个共享基因型(GT11、GT17和GT23)分别包含来自人和羊的菌株并呈现完全相同的MLVA-16基因型,表明羊是人间布病的传染源。GT35由3株分离自羊脾的菌株构成且共享相同的基因型,提示布病在羊中呈暴发流行。类群E由12个来自不同宿主(羊,牛,野生骆驼和人)的菌株构成,共享相同或相似的MLVA-16基因型,揭示了内蒙古羊种布鲁氏菌潜在的传播模式。结论疫羊是主要传染源,野生动物(骆驼)是贮藏宿主。羊种布鲁氏菌在羊牛(骆驼)和骆驼(羊牛)中相互循环传播,最后传染给人是内蒙古羊种布鲁氏菌的潜在传播模式。

羊种布鲁氏菌的分离鉴定及其ugpB基因的原核表达

对新疆某羊场流产胎儿进行布鲁氏菌病原分离、培养,采用细菌群体形态观察、PCR、生化试验进行鉴定,结果分离得到了羊种布鲁氏菌生物3型,命名为027株。应用常规分子生物学方法克隆羊种布鲁氏菌生物3型027株的ugpB基因,构建原核表达载体pET-ugpB,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白UgpB,进行SDS-PAGE和western blot分析,结果表明ugpB融合基因在大肠杆菌中得到了表达;采用Ni-NTAAgarose试剂盒进行蛋白纯化,获得了纯化的融合蛋白。

羊种布鲁氏菌生物3型的分离和鉴定

本实验对新疆某羊场小尾寒羊5只流产胎儿进行布鲁氏菌病原分离、鉴定,结果从5只流产胎儿胃内容物中均分离到羊种布鲁氏菌生物3型。表明新疆羊群中存在羊种布鲁氏菌生物3型病原。

南京市羊种布鲁氏菌分离鉴定及rpob基因分析

目的:分离鉴定及分子快速诊断方法确诊布鲁氏菌病,并对2011—2016年间南京地区分离到的布鲁氏菌rpob基因进行特征分析。方法:对疑似布鲁氏菌病患者全血进行分离培养,并通过生化鉴定、Real-time PCR对分离到的布鲁氏菌进行bcsp31基因特异性分析及IS-711插入序列分型。利用PCR方法对rpob基因进行扩增,产物测序并分析。结果:2011—2016年共收集到7株布鲁氏菌,经Real-time PCR方法检测,全部为羊种布鲁氏菌。通过测序分析发现7株羊种布鲁氏菌bpob基因仅出现1个碱基差异。结论:南京地区发现的布鲁氏菌病患者全部为羊种布鲁氏菌感染,羊种布鲁氏菌bpob基因高度同源,在种间水平上显示出良好的多态性。城市地区布鲁氏菌病的传播途径及危险因素更为复杂。

羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株VirB12基因缺失株的构建及鉴定

为获得毒力较弱且能够区分疫苗免疫与自然感染的羊种布鲁氏菌候选疫苗株,本研究构建羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株VirB12基因缺失突变株。分别扩增Rev.1疫苗株VirB12基因上下游同源臂序列以及卡那霉素抗性基因,采用融合PCR方法将3个基因片段连接构建突变盒,连接至pMD19-T载体,电转化入布鲁氏菌Rev.1感受态细胞筛选阳性克隆,获得Rev.1-ΔVirB12突变株。Rev.1-ΔVirB12连续传代15代未发生回复突变。羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1-ΔVirB12的构建为羊种布鲁氏菌疫苗研制奠定了基础。

羊种布鲁氏菌M5-90 omp31蛋白原核表达

克隆、测序布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白基因OMP31,原核表达OMP31并对其检测。从羊种布鲁氏菌M5-90中PCR获得OMP31基因,连接到pBS-T克隆质粒并测序;将测序正确的基因片段克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a,进行SDS-PAGE,而后Western-blot检测。结果M5-90疫苗株的OMP31基因序列与羊种布鲁氏菌参考株16M的同源性为99.03%;外膜蛋白基因OMP31在大肠杆菌表达后能够被Western-blot检测到。结论:表达的布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白OMP31可以被布鲁氏菌特异性血清识别,表现出良好的抗原性,为以后实验室诊断和疫苗的研究做好坚实的上游工作。

羊种布鲁氏菌Wzt基因的克隆及原核表达

为进一步研究Wzt蛋白在光滑型脂多糖合成路径中的作用,本试验利用PCR技术,以羊种布鲁氏菌16 M株基因组为模板,扩增出大小为759bp的Wzt基因片段,将其连入pMD20-T载体,测序正确后构建重组质粒pET-28a-Wzt,转化E.coli BL21（DE3）工程菌,IPTG诱导其表达,最后用Western blotting鉴定蛋白。结果显示,扩增出的Wzt基因片段大小为759bp,与GenBank中登录的羊种布鲁氏菌16M株Wzt基因序列（登录号：AF047478.1）同源性为99.87%,证明成功克隆了Wzt基因,同时成功构建了pET-28a-Wzt原核表达载体,并在E.coli BL21（DE3）工程菌中表达了Wzt蛋白,诱导得到的融合蛋白大小约为30ku,位于25～35ku之间,与目的蛋白大小一致,结果表明成功表达了目的基因。

贵州省2013-2021年羊种布鲁氏菌分离株的多位点可变数目串联重复序列分析

目的了解贵州省2013-2021年羊种布鲁氏菌的分子流行病学特征,为贵州省布鲁氏菌病疫情防控提供科学依据。方法以贵州省疾病预防控制中心2013-2021年分离、鉴定和保存的78株羊种布鲁氏菌分离株为研究对象,运用BCSP31-PCR及AMOS-PCR技术对分离株分别进行布鲁氏菌属及种的鉴定,运用多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA-16)技术进行分型分析。对MLVA分型结果进行整理及聚类分析,了解贵州省羊种布鲁氏菌的MLVA型别分布及分子流行病学特征。结果78株羊种菌分离株经BCSP31-PCR技术均鉴定为布鲁氏菌属细菌,AMOS-PCR技术将其均鉴定为羊种布鲁氏菌,MLVA-8分型技术将其分为5种MLVA型,MLVA-16分型技术将其分为46种MLVA型,其中遵义市的MLVA-16基因型型别分布最多。基于MLVA-16分型数据聚类分析显示,78株分离株亲缘关系较近,被聚类为4个群;最小生成树图显示,78株分离株被分为8个遗传复合体和14个单体。结论贵州省羊种布鲁氏菌MLVA型别呈多样性,提示贵州省布病疫情的病原体可能存在多条传播链。

羊种布鲁氏菌Rev.1突变株在BALB/c鼠中的免疫保护评价

为评价Rev.1-ΔKan-Vir B12突变株在BALB/c鼠中的免疫保护力,以Rev.1为参照,用Rev.1-ΔKanVir B12接种BALB/c小鼠,免疫45 d后用布鲁氏菌16M强毒株攻毒,15 d后取BALB/c鼠脾脏进行克脾指数测定和病理组织学检测。结果显示:BALB/c鼠免疫攻毒15 d后,Rev.1-ΔKan-Vir B12免疫组和Rev.1免疫组的克脾指数与对照组之间有显著性差异(P<0.05),而Rev.1免疫组与Rev.1-ΔKan-Vir B12免疫组之间的克脾指数差异不显著(P>0.05)。结果表明,羊布鲁氏菌Rev.1-ΔKan-Vir B12突变株与其亲本Rev.1株的免疫保护性无明显差异,具备作为布鲁氏菌病标记疫苗的潜力。

羊种布鲁氏菌16M不同生物型及非典型株间微孔蛋白的结构变化规律

羊种布鲁氏菌16M不同生物型及非典型株间微孔蛋白结构存在着规律性的变化。光滑型菌外膜上的脂多糖不同程度的脱落导致16M光滑型向16M中间过渡型与粗糙型转变,表现为16M中间型与粗糙型微孔蛋白SDS-PAGE电泳谱型与16M光滑型的谱型基本相同,仅有清晰程度与单体迁移的改变。与此对照羊种光滑型布鲁氏菌微孔蛋白自身的变异,是羊种布鲁氏菌在光滑型基础上向非典型株转变的原因。

羊种布鲁氏菌疫苗株PCR-RFLP鉴定方法的建立

为建立一种羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株PCR-RFLP鉴定方法,利用羊种布鲁氏菌Rev.1具有链霉素抗性的特性,选取与链霉素抗性相关编码核糖体蛋白S12的rps L基因为模板设计引物,经PCR扩增后,将产物进行Nci I酶切,发现羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1出现约500 bp条带,而不具有链霉素抗性的羊种布鲁氏菌株16M则出现384 bp条带。结果表明,PCR-RFLP方法能够用于羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株的鉴定,这为今后区分羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1免疫与野株感染提供了基础。

广西黑山羊羊种布鲁氏菌的分离和鉴定

为了对一起黑山羊流产死胎的病原进行诊断,采集10份黑山羊血清进行布鲁氏菌病抗体检测,并采集流产胎儿进行细菌的分离。虎红平板凝集试验结果表明10份血清全为阳性,试管凝集试验检测有8份血清为阳性;对流产死胎分离出的细菌进行PCR鉴定证实该细菌为羊种布鲁氏菌。

羊种布鲁氏菌单克隆抗体研究及应用

本实验应用淋巴细胞杂交瘤技术,建立了分泌抗布鲁氏菌弱毒疫苗M5(或M5—90)菌株的株系特异的单克隆抗体(McAb),杂交瘤细胞株(IC—11)。以其分泌的IC—11McAb的酶结合物,M5菌株特异抗原(P_2)和受检血清建立的免疫班点试验(DB),具有特异地识别出动物出动物接种M5或M5—90疫苗血清抗体能力,其DB反应阴性的血清,再作凝集试验呈阳性为自然感染动物,本法适(?)用布氏菌M5或M5—90疫苗免疫予防地区布病的发病与疫苗接种动物的鉴别,经若干(?),对2573份动物检测,证实有良好的实用价值。

羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株铁应答调控因子irr和rirA基因缺失株的构建与鉴定

为研究铁调控因子irr和rirA在羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)感染过程中的作用,本研究通过卡那替换的方法构建两个缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA,分别将亲本株和缺失株在相同营养条件下培养36 h,观察其振荡培养时的生长变化趋势。分别将1×108 CFU M5-90Δirr、M5-90ΔrirA和M5-90接种到含1.5 mol/L NaCl、pH 2.5、pH 11.5、10 mmol/L H 2O 2的1 mL布鲁氏菌液体培养基,比较缺失株和亲本株在不同条件下的生长特性;分别以1×106 CFU M5-90Δirr、M5-90ΔrirA和M5-90感染小鼠巨噬细胞RAW264.7检测缺失株的黏附、侵袭和胞内生存能力。结果显示,在相同体外培养条件下缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA生长速度明显低于亲本株;M5-90Δirr、M5-90ΔrirA在高盐、强酸和强碱环境下生存率均显著或极显著低于亲本株(P<0.05;P<0.01),在H 2O 2条件下这两个缺失株的生存率却显著高于亲本株(P<0.05)。与亲本株相比,缺失株在小鼠巨噬细胞RAW264.7内的侵袭和黏附能力均减弱,在感染后45 min缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA的黏附和侵袭能力均极显著低于亲本株(P<0.01),但在感染后24 h,这两个缺失株在细胞内繁殖能力与亲本株相比有所增强。本研究报道了irr和rirA基因不仅调控了羊种布鲁氏菌的生长,同时对细菌黏附和侵袭能力也产生一定的影响,M5-90Δirr和M5-90ΔrirA是两株具有潜力的布鲁氏菌候选疫苗株。

新疆羊种布鲁氏菌分离株的鉴定与L7/L12蛋白的原核表达和生物信息学分析

【目的】分离并鉴定新疆羊种布鲁氏菌。原核表达该菌的L7/L12蛋白,检测该蛋白的反应原性及进行部分生物学分析。【方法】采用细菌划线培养、形态学观察、PCR检测以及生化试验进行布鲁氏菌分离鉴定。利用常规分子生物学方法表达并纯化羊种布鲁氏菌分离株的L7/L12蛋白,应用Western Blot分析融合蛋白的反应原性。使用生物信息学软件对该蛋白进行了生物信息学分析。【结果】分离鉴定确定该菌株为羊种布鲁氏菌。经过测序与酶切鉴定,正确构建了表达载体p ET-28a-L7/L12.SDS-PAGE试验显示纯化的L7/L12蛋白为单一条带;经过Western Blot检测,该融合蛋白具有良好的反应原性。生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,不存在信号肽,二级结构α-螺旋为主并利用Phyre2服务器成功构建了该蛋白的三维模型。【结论】鉴定出该分离菌株,表达并纯化了该菌的L7/L12融合蛋白,Western Blot证明该蛋白具有良好的反应原性,为后续该蛋白的亚单位疫苗研究奠定了基础。

一起羊种布鲁氏菌病暴发的流行病学和分子特征研究

目的调查研究一起羊养殖场中发生的人畜共患羊种布鲁氏菌病(布病)暴发疫情的流行病学和分子特征。方法血清学实验采用试管凝集试验检测布病抗体,采用纸片法检测菌株的药物敏感性,采用多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)和多位点序列分析(MLST)分析菌株的分子特征。结果工作人员布鲁氏菌抗体阳性率为7/18,饲养羊的阳性率为5/8。2名工作人员血液分离培养出羊种布鲁氏菌(菌株编号:CQ-18和CQ-11),3只羊的血液分离培养出羊种布鲁氏菌(菌株编号:CQ-154、CQ-159和CQ-237)。药敏实验结果:5株菌对环丙沙星、左氧氟沙星、强力霉素、头孢曲松、诺氟沙星、米诺霉素、莫西沙星、氧氟沙星、利福平和链霉素敏感,CQ-154和CQ-237菌株对复方新诺明敏感,CQ-159、CQ-18和CQ-11菌株对复方新诺明耐药,5株菌均对阿奇霉素和克拉霉素耐药。MLVA分析发现,CQ-154菌株在BRU16位点少了一个串联重复序列,菌株CQ-18在BRU04位点增加了一个串联重复序列,MLST分析5株菌株ST型为8型。结论布鲁氏菌长期在动物体内存在,是人畜感染布病无法根治的一个关键问题。在我国首次发现对复方新诺明耐药的羊种布鲁氏菌菌株。

重庆市首起羊种布鲁氏菌病暴发疫情的调查

目的阐述重庆市首起羊种布鲁氏菌病疫情的传染源、传播途径及处置过程。方法通过流行病学调查,收集病例的临床、实验室资料。同时收集畜间疫情资料。结果畜间共检疫316头羊,布病血清学阳性率为33.86%（107/316）。共发现8例布病感染病例,男性7例,女性1例,男女性别比为7∶1;年龄主要分布在22～62岁之间,中位数为50.5岁;职业分布兽医3例,圈舍卫生2例,饲养员、羊场管理员、饲养员家属各1例;均在该羊场从事生产、管理等工种,在该场工作时间最短4个月,最长2年。2例发病,从1例患者血液中分离出羊种布鲁氏菌3型。结论这是一起因人间密切接触羊种布鲁氏菌引起的布病疫情,应加强人群监测和畜间源头监管,进行健康教育和行为干预。

江西省羊种布鲁氏菌分子流行病学特征分析

目的掌握江西省羊种布鲁氏菌分子特征,了解分离菌株流行病学间相关性。方法采用多位点可变数目串联重复序列分析方法(MLVA)对江西省17个县(区)25株人分离羊种布鲁氏菌进行分析。结果25株羊种布鲁氏菌聚类可分为24个独立基因型,相似度为67.00%~100.00%,辛普森指数在0.000~0.773之间,MLVA8型有3个基因型,60.00%(15/25)为42型,32.00%(8/25)为43型,8.00%(2/25)为63型。MLVA11型有7个基因型,116、125型为主要基因型,两型菌株占56.00%(14/25)。结论25株人分离羊种布鲁氏菌基因具有高度遗传多样性,菌株基因型繁多,各菌株间无明显流行病学相关性,表明江西省羊种布鲁氏菌传染来源复杂。

我国羊种布鲁氏菌rpoB基因遗传多态性分析

目的调查中国羊种布鲁氏菌rpoB基因的多态性。方法利用AMOS-PCR对分离菌株进行种型鉴定;根据布鲁氏菌rpoB基因的4个多态性位点设计特异性引物,对299株羊种布鲁氏菌流行株(羊1型菌38株、羊2型菌19株、羊3型菌242株)的rpoB基因的4个多态性位点进行扩增,并将PCR产物测序结果与羊种布鲁氏菌标准菌株的扩增结果进行比对。结果羊种布鲁氏菌的rpoB基因检测发现,有169株为rpoB-2变异型、103株为rpoB-2型、24株为新的rpoB基因型(rpoB-4型)及3株为rpoB-1型。结论我国羊种布鲁氏菌rpoB基因具有较高的多态性,可作为羊种布鲁氏菌的分子流行病学调查靶基因,我国羊种菌rpoB基因型和生物型无相关性。