羊耳菊提取物的抑菌动力学研究

[目的]研究羊耳菊不同浓度提取物对细菌存活率随时间变化的关系,以及不同pH值条件下提取物的抑菌效果。[方法]以金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门氏菌为供试菌种,绘制时间杀菌曲线和浓度杀菌曲线。在提取物浓度为最低抑菌浓度(MIC)时培养24h,测定不同pH值条件下的抑菌率。[结果]羊耳菊提取物对金黄色葡萄球菌和甲型副伤寒沙门氏菌的MIC、最低杀菌浓度(MBC)分别为62.5、125.0mg/ml和125.0、250.0mg/ml。绘制了羊耳菊提取物16MIC、4MIC、2MIC、MIC、1/2MIC和对照条件下的杀菌曲线。羊耳菊水提物抑菌作用最适pH值为6～8。[结论]羊耳菊提取物对金黄色葡萄球菌的杀菌作用在较高浓度时并没有进一步提高杀菌速度,表现为时间依赖性,但对甲型副伤寒沙门氏菌表现为浓度性依赖性。

羊耳菊提取物对大鼠和人肝微粒体CYP450酶的体外抑制作用

目的:考察羊耳菊(YEJ)提取物对大鼠和人肝微粒体CYP450酶的6种主要亚型酶的抑制作用。方法:采用钙盐沉淀法提取肝微粒体,在肝微粒体孵育体系中,用PBS溶液将YEJ提取物逐级稀释至5个不同浓度(0.01、0.05、0.25、0.5、1 g/L),分别与混合探针底物(非那西丁、氯唑沙宗、右美沙芬、奥美拉唑、甲苯磺丁脲、咪达唑仑和睾酮)共同孵育,采用超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定6种探针底物对应代谢物的生成量,以空白溶剂组的代谢物生成量为V 0,其余不同YEJ提取物浓度的代谢物生成量为Vx,求得剩余酶活性I=(1-Vx/V0)×100,通过GraphPad v 5.0软件拟合曲线,并计算IC 50值。结果:YEJ提取物对大鼠肝微粒体CYP1A2、CYP2C11、CYP2C19、CYP2D4、CYP2E1和CYP3A2的IC 50值范围为0.287~152.407 g/L,对人肝微粒体CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的IC 50值范围为0.258~19.275 g/L。结论:YEJ提取物对大鼠和人肝微粒体中6种亚型酶活性存在较弱的抑制作用。

羊耳菊提取物主要活性成分在大鼠体内的组织分布研究

为了研究大鼠灌胃羊耳菊提取物后7个指标成分在体内的组织分布情况,实验建立同时测定大鼠组织中4,5-二咖啡酰基奎宁酸、新绿原酸、绿原酸、3,4-二咖啡酰基奎宁酸、1,3-二咖啡酰基奎宁酸、隐绿原酸、木犀草苷的UPLC-MS/MS方法,将羊耳菊提取物灌胃给予SD大鼠,分别于给药0.5、1.5、5 h取其主要脏器和组织,采用UPLC-MS/MS测定各时间点下7个指标成分在脏器和组织中的分布情况。大鼠灌胃羊耳菊提取物后,对于新绿原酸,其浓度0.5 h在小肠、肾、肺、肝达到峰值;1.5 h在胃、肌、脾达到峰值;5 h在心达到峰值。对于绿原酸,其浓度0.5 h在小肠、肾、肺、心达到峰值;1.5 h在胃、肌、脾、肝达到峰值。对于隐绿原酸,其浓度0.5 h在小肠、肾、肺达到峰值;1.5 h时在心、肝、脾、肺、胃达到峰值。对于1,3-二咖啡酰基奎宁酸,其浓度0.5 h在心、肺、肾、小肠达到峰值;1.5 h在肝、脾、肌、胃达到峰值。对于3,4-二咖啡酰基奎宁酸,其浓度0.5 h在小肠和肾达到峰值;1.5 h在肝、脾、肌、胃达到峰值;5 h在心、肺达到峰值。对于4,5-二咖啡酰基奎宁酸,其浓度0.5 h在小肠、肾、心达到峰值;1.5 h在肝、脾、肌、胃达到峰值;5 h在肺达到峰值。对于木犀草苷,其浓度0.5h在小肠和心达到峰值;1.5 h在肝、脾、胃达到峰值;5 h在肺和肾达到峰值。7个指标成分可迅速、广泛地分布在各组织器官中,脑组织中未检测到该7种成分。7种成分主要分布在胃、小肠和肾组织中,对肾脏表现出较强的亲和力,推测肾脏可能是羊耳菊的主要排泄器官之一。

大鼠肠道菌群对羊耳菊提取物的代谢作用研究

考察大鼠肠道菌群对羊耳菊提取物中主要成分的代谢作用,将羊耳菊提取物与大鼠肠道菌液在厌氧条件下共同孵育24 h,通过正丁醇液液萃取处理后,采用色谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS/MS)对代谢产物进行定性分析,并结合布鲁克公司研发的数据处理工具Metabolite Tools,Data Analysis等对代谢信息进行综合分析。通过比较空白样品图谱,肠菌样品图谱以及两者的差异图谱,各色谱峰的准分子离子,碎片离子,分析羊耳菊提取物在大鼠肠道菌群作用下可能产生的代谢产物。结果提示,羊耳菊提取物在肠道菌群作用下,检测到14个代谢产物,主要包括单咖啡酰基奎宁酸的异构,水解的小分子化合物和咖啡酸的还原,甲基化和乙酰化等代谢产物,同时仅检测到1个二咖啡酰基奎宁酸的甲基化代谢产物。以此推测,咖啡酰基奎宁酸类成分在肠道菌群的作用下可能多数水解为分子量小,疏水性更强的代谢产物,使得其更容易被肠道吸收。

外翻肠囊法研究羊耳菊提取物在大鼠肠内的吸收

考察羊耳菊提取物在大鼠肠内的吸收特征,应用大鼠肠外翻模型,选择羊耳菊提取物中具有代表成分的东莨菪苷等9种成分为考察对象,建立其UPLC-MS/MS测定方法并测量其累计吸收量,阐明各成分在不同肠段的吸收特征。结果表明,不同浓度的1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸等成分随活性部位提取物的给药剂量增加而增加,无明显高浓度饱和现象,提示其可能的吸收方式均为被动扩散,东莨菪苷同样在高浓度条件下存在饱和现象,提示可能的吸收方式为主动转运。绿原酸的主要吸收部位在十二指肠,1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草苷、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸和隐绿原酸的最佳吸收部位是空肠,东莨菪苷,新绿原酸,3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的最佳吸收部位在回肠。以此推测,羊耳菊提取物中9种成分在小肠均有吸收,但各成分的吸收速率、最佳吸收部位及吸收机制不尽相同,提示小肠对羊耳菊提取物中9种成分的吸收具有选择性。

苗药羊耳菊中7个抗炎活性成分在Raw264.7细胞中含量测定方法的建立

目的:建立同时测定Raw264.7细胞中羊耳菊提取物中7个抗炎活性成分木犀草苷(luteolin,LUT)、绿原酸(chlorogenic acid,CA)、新绿原酸(neochlorogenic acid,NCA)、隐绿原酸(cryptochlorogenic acid,CCA)、3,4-二咖啡酰基奎宁酸(3,4-dicaffeoylquinic acid,3,4-DCQA)、3,5-二咖啡酰基奎宁酸(3,5-dicaffeoylquinic acid,3,5-DCQA)、4,5-二咖啡酰基奎宁酸(4,5-dicaffeoylquinic acid,4,5-DCQA)含量的方法。方法:以小鼠巨噬细胞Raw 264.7为研究对象,采用超高液相色谱-三重四级杆质谱联用仪(UPLC-MS/MS)建立同时测定Raw 264.7细胞中LUT、CA、NCA、CCA、3,4-DCQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA等7个成分含量的方法,包括专属性、线性、基质效应、回收率、准确度、精密度和稳定性等。结果:建立了一个快速稳定测量Raw264.7细胞中微量药物的分析方法,该方法的最低定量限为0.48~3.84 ng/mL,准确度为(90.78±5.30)%~(113.99±13.51)%,提取回收率为(87.19±5.33)%~(103.59±14.00)%,基质效应为(94.50±15.17)%~(112.77±7.02)%,稳定性为(91.71±11.70)%~(109.45±10.63)%,能够满足测量的要求。结论:建立了快速、准确的同时测定Raw264.7细胞羊耳菊提取物中7个活性成分(LUT、CA、NCA、CCA、3,4-DCQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA)含量的UPLC-MS/MS方法,为开展羊耳菊提取物的细胞药代动力学研究奠定基础。