体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力

背景:人羊膜上皮细胞具有多系分化能力,是再生医学中重要的细胞来源。目前的研究多集中于对其分化能力的考察,而体外培养过程中羊膜上皮细胞的生物学特征如何变化尚不清楚。目的:分析体外培养对人羊膜上皮细胞生长、表型及向心肌样细胞分化的能力等生物学特性的影响,探讨原代人羊膜上皮细胞干性标志物SSEA-4的表达水平与人羊膜上皮细胞生物学特性变化之间的关联性。方法:使用统一分离方法获得原代羊膜上皮细胞并进行体外培养。利用CCK-8、流式细胞仪及real-time PCR等手段检测不同培养阶段人羊膜上皮细胞的增殖、表型以及向心肌样细胞分化的能力。结果与结论:不同胎儿样本来源的原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达在26.7%-97%,存在很大的个体差异。并且,随着传代次数的增加,人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平显著降低,其下降程度与原代SSEA-4的表达水平无关。另外,培养后人羊膜上皮细胞的心肌分化潜能也存在很大个体差异,且其差异与原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平的高低无关。结果提示,不同胎儿样本来源的原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平受到个体差异的影响,需要建立更准确的临床样本筛选指标来稳定获得原代高表达SSEA-4的胎儿样本,以实现对人羊膜上皮细胞的质量监控。另外,体外培养过程中SSEA-4的表达水平受到培养条件的影响,需要继续优化培养条件以维持其高表达。此外,人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力受到样本个体差异以及培养条件的影响,在今后还需要进一步研究。

人羊膜上皮细胞有向心肌样细胞分化的特性

目的:通过体外诱导分化实验,评价人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力。方法:实验于2005-09/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成。①对象:经产妇知情同意,无菌采集健康足月剖宫产胎盘6份,实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法:采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离,D-Hank’s液冲洗后剪成碎片,加入含有0.2g/L乙二胺四乙酸的0.5g/L胰蛋白酶溶液,离心、消化、过滤,收集滤液,加入胎牛血清终止消化,重复消化2次。合并3次消化所得的细胞悬液,离心后将细胞沉淀悬浮于L-DMEM培养基中,按1.25×108L-1密度接种,常规培养3d后更换培养基,待细胞达80%～90%融合后用胰蛋白酶+乙二胺四乙酸联合消化,终止后离心弃上清,细胞沉淀用培养基重新悬浮,按1×107L-1密度传代。③实验评估:用流式细胞仪鉴定人羊膜上皮细胞表型;使用10μmol/L5-氮杂胞苷和1mmol/L抗坏血酸磷酸盐诱导第2代人羊膜上皮细胞,免疫荧光染色法检测诱导后细胞中特异蛋白结蛋白和α-辅肌动蛋白的表达,RT-PCR检测心肌特异性转录因子Nkx2.5、GATA-4和心肌特异性收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA的表达。结果:①人羊膜上皮细胞的免疫组化特征:人羊膜上皮细胞几乎不表达CD44,不表达波形蛋白,表达角蛋白19。②人羊膜上皮细胞α-辅肌动蛋白和结蛋白的表达:人羊膜上皮细胞经诱导分化后,表达肌系细胞标志α-辅肌动蛋白和结蛋白。③人羊膜上皮细胞Nkx2.5、GATA-4和α-肌球蛋白重链mRNA的表达:人羊膜上皮细胞经诱导分化后,表达心肌特异性转录因子Nkx2.5 mRNA和GATA-4 mRNA,心肌特异的可收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA未见表达。结论:通过胰蛋白酶消化法分离获得的人羊膜上皮细胞具有向心肌样细胞分化的特性,可能成为细胞心肌成形术的候选供体细胞。

CCK-8和MTS法检测人羊膜上皮细胞增殖的比较

目的探讨CCK-8、MTS两种不同的四唑盐试剂在羊膜上皮细胞增殖检测中的最适实验条件,并比较两者细胞毒性。方法取体外培养对数生长期羊膜上皮细胞,用完全培养基（DMEM/F12＋10%胎牛血清）配制成不同浓度的细胞悬液加入96孔板中培养24 h,分别加入CCK-8、MTS后于450 nm、492 nm波长处测定光密度（OD）。在同一细胞浓度下,根据同一波长不同时间检测的OD确定CCK-8的最佳孵育时间。取体外培养的对数生长期羊膜上皮细胞分别用DMSO、CCK-8、MTS处理1 h、2 h、3 h和4 h后,继续培养24 h,在450 nm处以CCK-8检测细胞增殖,并通过台盼蓝染色计数活细胞数。结果 CCK-8法的最佳波长为450 nm,MTS法的最佳波长为492 nm。CCK-8法灵敏度稍低于MTS法。1~4 h内,CCK-8试剂与待检测细胞最佳孵育时间为4 h。CCK-8法对细胞增殖影响及细胞毒性均小于MTS法。结论 CCK-8法是一种更为方便、细胞毒性作用较小的试剂。

复方丹参注射液对人羊膜上皮细胞水通道蛋白3表达的影响

目的研究复方丹参注射液对人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,hAECs)水通道蛋白3(aquaporin 3,AQP3)表达的影响,探讨复方丹参注射液治疗羊水量过少的机制。方法选取无并发症的8例羊水过少和8名羊水量正常的足月产妇的hAECs进行原代培养,采用RT-PCR和免疫印迹Western blot技术,检测复方丹参注射液不同浓度(0.000、0.001、0.010、0.020、0.060、0.100mg/mL)、不同作用时间(0、6、12、24、48h)作用前后,两组hAECs中AQP3 mRNA和蛋白的表达。结果 (1)羊水过少组hAECs中AQP3的表达较羊水正常组下调(P<0.05)。(2)复方丹参注射液浓度为0.010mg/mL时,两组hAECs中AQP3的表达均达到峰值,与其他浓度作用结果比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)0.010mg/mL浓度的复方丹参注射液作用12h,两组hAECs中AQP3的表达均达到峰值,与其他作用时间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)0.010mg/mL浓度的复方丹参注射液作用12h后,两组hAECs中AQP3的表达均上调,但羊水过少组中AQP3的表达上调较羊水正常组明显(P<0.05)。结论复方丹参注射液可调节hAECs中AQP3的表达,羊水过少时复方丹参注射液对hAECs中AQP3表达的调节作用更加明显。

人羊膜上皮细胞的干细胞特性

背景:研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。目的:研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性。方法:取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达。结果与结论:人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性。结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。

羊膜上皮细胞移植治疗帕金森病大鼠的实验研究

目的探讨羊膜上皮细胞纹状体内移植对帕金森病(PD)大鼠的治疗作用。方法采用RT-PCR方法检测人羊膜上皮细胞株FL表达脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)mRNA;Hoechest33342标记后微移植方法将其移入PD大鼠模型纹状体内,免疫荧光技术检测移植细胞表达BDNF、NT-3状况。结果羊膜上皮细胞能够表达BDNF、NT-3,植入纹状体内能够存活,并在第2周内明显改善PD大鼠的行为学症状。结论羊膜上皮细胞可作为表达神经营养因子治疗PD的移植细胞。

人羊膜上皮细胞的诱导分化

目的:建立体外培养及标记人羊膜上皮细胞(HAECs)的方法并应用原子力显微镜(AFM)从细胞形貌变化上探讨人羊膜上皮细胞向角膜上皮细胞转分化的可视性研究。方法:取足月产人羊膜,采用酶消化法获得HAECs进行原代和传代培养,对培养的细胞进行形态学观察和鉴定;HAECs与兔角膜基质细胞共培养2周,采用CK3+12免疫荧光细胞化学染色鉴定诱导后的细胞;应用AFM分别对共培养前后的人羊膜上皮细胞的表面超微结构进行观察,并与人角膜上皮细胞(HCECs)对比,分析细胞形貌的变化。结果:HAECs体外培养呈铺路石样外观,核/质比率小,连接成片。细胞形态为多角形,角蛋白keratin表达阳性,不表达CK3+12;免疫荧光显示共培养2周的HAECs表达CK3+12;AFM观察,共培养2周后HAECs细胞核中央由山谷样外观转变成类似HCECs的山峰样外观。结论:HAECs可成功进行原代和传代培养,在兔角膜基质细胞诱导培养条件下可向角膜上皮细胞转分化。

人羊膜上皮细胞的分离、纯化及其生物学特性研究

目的体外分离人羊膜上皮细胞并纯化,对体外培养的人羊膜上皮细胞的生物学特性进行相关研究。方法取足月剖宫产的人羊膜组织,经胰蛋白酶、胶原酶和Dnase酶消化后,采用差异黏附法获得纯度高的羊膜上皮细胞,接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用HE染色法对培养细胞进行形态学观察,并采用免疫组化法检测细胞角蛋白CK7、CK8、CK18在体外培养的人羊膜上皮细胞中的表达。结果经不同的消化酶消化和差异黏附法筛选后能获得纯度较高的人羊膜上皮细胞,在体外培养条件下人羊膜上皮细胞呈上皮细胞特有的铺路石样外观,并能连续传代8～10次,细胞角蛋白CK7、CK8、CK18在其胞浆中呈阳性表达。结论人羊膜上皮细胞能在体外成功分离、纯化、培养并增殖,为人羊膜上皮细胞的进一步研究及其在细胞移植和组织工程中的应用奠定了实验基础。

人羊膜上皮细胞治疗大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的效应及免疫调节作用

目的:观察人羊膜上皮细胞(hAECs)对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型的治疗效应和免疫调节作用。方法:分离、培养hAECs,流式细胞术(FCM)检测其免疫表型;用豚鼠脊髓匀浆+完全弗氏佐剂+百日咳毒素复制大鼠EAE模型;EAE大鼠经双侧侧脑室移植5×105个hAECs;采用kono评分动态观察行为学变化;采用HE染色、免疫荧光染色观察脑和脊髓病理改变,以及hAECs在脑和脊髓内的分布;采用FCM检测外周血淋巴细胞亚群,采用流式微球芯片捕获技术(CBA)检测血浆细胞因子的含量。结果:hAECs治疗后EAE大鼠行为学评分逐渐减低(P<0.01),神经功能明显改善,体重稳定,脑和脊髓炎性细胞浸润减轻。hAECs移植后3周,宿主脑和脊髓组织中均有较多人细胞核抗原阳性细胞即hAECs存活;与对照组相比,hAECs治疗组FoxP3+Treg、Th2、CTL、NKT、B淋巴细胞百分比明显升高(P<0.01或P<0.05),而Th17细胞显著减少(P<0.01);Th2型细胞因子IL-4和IL-10含量升高(P<0.05或P<0.01),而Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ含量降低(P<0.05或P<0.01)。结论:hAECs能改善大鼠EAE的神经功能,减轻神经组织的免疫损伤,其机制可能主要与上调FoxP3+Treg和下调Th17细胞有关。

神经组织细胞特异性蛋白在大鼠羊膜上皮细胞中的表达

目的检测神经组织细胞特异性抗原及神经营养因子 3 (NT 3 )、乙酰胆碱转移酶 (ChAT)在大鼠羊膜上皮细胞中的表达。方法从孕 12— 14d的Wistar大鼠羊膜中分离羊膜上皮细胞 ,通过免疫细胞化学检测神经组织细胞特异性抗原 (MAP 2、NSE、GFAP、Nestin、Musashi)及ChAT、NT 3在羊膜上皮细胞中的表达。结果羊膜上皮细胞表达神经干细胞、神经细胞、神经胶质细胞特异性抗原 ,并且在羊膜上皮细胞中有ChAT与NT 3的表达。结论羊膜上皮细胞与神经组织细胞具有一定的同源性 ;羊膜可望作为治疗神经系统疾病新的细胞来源。

甲强龙、电针联合羊膜上皮细胞移植对脊髓损伤大鼠轴浆运输功能及GFAP表达的影响

目的:探讨甲强龙(MP)、电针与羊膜上皮细胞(AECs)联合治疗对脊髓损伤(SCI)大鼠轴浆运输功能的影响,为临床治疗脊髓损伤寻找一种更为有效的方法。方法:将60只成年雌性Wistar大鼠随机分成5组,每组12只。脊髓损伤对照组:做脊髓损伤模型,不进行治疗;甲强龙组:脊髓损伤后,用大量甲强龙药物冲击治疗,共3d;甲强龙+电针组:在甲强龙治疗基础上,脊髓损伤后4h,行华佗夹脊穴电针治疗;甲强龙+电针+AECs组:在甲强龙+电针组基础上,脊髓损伤后第7天,在脊髓损伤处移植大鼠AECs联合治疗;假手术组:只打开椎板,暴露脊髓,不造成脊髓损伤。各组每隔6d进行行为学观察(BBB评分),术后30d行荧光红(FR)顺行示踪和GFAP免疫荧光组织化学观察。结果:BBB评分显示,脊髓损伤后经过治疗各组都有不同程度的后肢功能恢复,其中以甲强龙+电针+AECs组恢复最为明显,第30天,BBB评分可恢复到15.23±1.01。荧光红(FR)顺行示踪,甲强龙+电针+AECs组可见大量有序的FR阳性神经纤维,神经示踪剂能被运输到脊髓损伤区远侧端较远的距离;100倍荧光显微镜下观察,损伤区FR阳性神经纤维数为312.67±34.06,与其他治疗组比较差异有显著性(P<0.01);GFAP表达结果,各组GFAP阳性细胞较假手术组均明显增高,而甲强龙+电针+AECs组的表达量低于其他损伤组,200倍荧光显微镜下观察,损伤区GFAP阳性细胞数为633.61±54.4,与其他治疗组比较差异有显著性(P<0.01)。结论:甲强龙、电针与AECs联合治疗脊髓损伤能够有效地抑制星形胶质细胞的过度增生,恢复脊髓轴浆运输功能,促进神经纤维再生。

人羊膜上皮细胞的体外培养及标志分子的检测分析

目的进行人羊膜上皮细胞(HAEC)的体外培养,观察其生物学特性,检测其分子特征。方法取剖宫产术后人羊膜,应用酶消化法获得HAEC,倒置显微镜下观察细胞生长变化;CCK-8法检测HAEC的生长曲线;Giemsa染色观察HAEC的克隆形成率;流式细胞术检测HAEC的细胞周期;取第2代HAEC,流式细胞术检测其CD29、CD31、CD44、CD59、CD105、CD117、CD133、HLA-DR的表达。免疫荧光法检测其CD9、上皮性钙黏素(E-cadherin)、足糖萼素样蛋白(PODXL)、阶段特异性胚胎表面抗原4(SSEA-4)、性别决定区Y相关因子2蛋白(SOX2)、SSEA-1、Nanog蛋白、八聚体结合蛋白3/4(Oct-3/4)的表达情况。结果酶消化法可以获得较纯的HAEC,细胞呈贴壁生长,呈多角形,核呈圆形。细胞在贴壁后第3天进入指数生长期。细胞周期分析显示66%处于G0/G1期,S期细胞占31.69%,G2/M期细胞占2.31%。HAEC的克隆形成率为(9.33±2.00)%。流式细胞仪检测显示HAEC阳性表达CD44、CD29、CD105、CD59,不表达CD31、CD117、CD133、HLA-DR。免疫荧光法检测显示HAEC表达胚胎干细胞相关分子CD9、E-cadherin、PODXL、SSEA-4、SOX2、SSEA-1、Nanog、Oct-3/4。结论HAEC可以在体外培养生长并在一定时期内保持其增殖活性;HAEC表达胚胎干细胞相关的表面标志分子。

双室共培养中人羊膜上皮细胞诱导分化为腺泡细胞样细胞研究

目的:研究人羊膜上皮细胞(hAECs)体外诱导分化为唾液腺腺泡细胞样细胞的可能性。方法:分离hAECs并体外培养、鉴定。与8 d龄SD大鼠下颌下腺细胞(SMGCs)在双室共培养系统中共培养。免疫细胞化学、实时荧光定量RT-PCR等方法检测α-淀粉酶及其mRNA的表达。结果:双室共培养1、2周,hAECs中α-淀粉酶mRNA的表达量分别为共培养前的3.38倍及6.6倍。结论:hAECs具有向唾液腺腺泡细胞样细胞分化的能力。

兔骨髓间充质干细胞及人羊膜上皮细胞移植治疗兔角膜缘干细胞缺损的研究

背景角膜缘干细胞缺乏可引起致盲性眼病，但传统的治疗方法疗效欠佳。最近的研究表明，骨髓间充质干细胞（BMSCs）和人羊膜上皮细胞（AECs）有分化成多种细胞的能力，但其对角膜缘于细胞缺乏的疗效仍有待研究和评价。目的观察和对比兔BMSCs和人AECs移植治疗兔角膜缘干细胞缺损的治疗效果。方法将18只新西兰白兔采用随机数字表法分为羊膜基质（AS）移植组、兔BMSCs移植组和人AECs移植组，每组6只。将浸有NaOH溶液的滤纸贴附于角膜表面建立碱烧伤角膜缘干细胞缺损的动物模型。抽取兔髂窝处骨髓并收集人胎盘组织分别分离、制备兔BMSCs和人AECs，通过密度梯度离心加贴壁培养法及胰蛋白酶多次分步消化法获取兔BMSCs和人AECs，采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法对培养细胞进行鉴定，再接种于人去上皮AS上，按照动物的分组分别将上述材料缝合至动物模型的角膜表面。术后28d，对各组动物的角膜新生血管（CNV）评分以及角膜混浊度评分进行对比，对角膜组织行组织病理学检查并针对角膜上皮细胞特异性标记物细胞角蛋白3（CK3）行免疫组织化学染色。结果第3代兔BMSCs接种于AS载体上12h后贴附生长，第1代人AECs接种于AS载体上48h后呈单层膜状生长，传代细胞经RT—PCR鉴定符合目标细胞的特征。兔BMSCs移植组术后28d，免疫组织化学染色结果显示，兔BMSCs移植组和人AECs移植组的角膜表面细胞CK3均呈阳性表达，而AS组CK3表达阴性。与AS移植组比较，兔BMSCs移植组和人AECs移植组CNV评分以及角膜混浊度评分明显降低，差异均有统计学意义（BMSCs：Z=-2．983，P=0．003；Z=-2．844，P=0．004；AECs：Z=-2．817，P=0．005；Z=-2．041，P=0．041）。组织病理学检查显示，AS组兔角膜组织有较多的炎性细胞生长，胶原纤维排列紊乱。兔BMSCs组术后角膜表层形成了角膜上皮样的复层结构，无明显杯状细胞，角膜基质内无新生血管生长，炎性细胞减少，胶原纤维排列更加规则，且兔BMSCs移植组角膜透明度明显优于人AECs移植组，差异有统计学意义（Z=-2．091，P=0．037），而2组间CNV评分的差异无统计学意义（Z=-0．267，P=0．789）。结论移植至兔角膜缘干细胞缺损角膜表面的兔BMSCs和人AECs均能分化为角膜上皮细胞样细胞，可抑制CNV，减轻角膜混浊。在改善角膜透明度方面，兔BMSCs优于人AECs。

慢病毒介导EGFP基因修饰的人羊膜上皮细胞重建角膜表层的实验研究

背景研究发现人羊膜上皮细胞（AECs）具有干细胞的某些特性，已有学者用其进行眼表重建，其可能是角膜表层重建的一种新型种子细胞。目的探讨经慢病毒载体（pLenti6／V5一DEST）介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因修饰的人AECs作为组织工程化角膜表层一种新的细胞来源的应用价值。方法利用慢病毒载体携带标记基因EGFP转染人AECs，荧光显微镜下观察转染基因的瞬时表达，倒置显微镜下观察转染细胞的生长形态，用流式细胞仪检测转染细胞中EGFP的阳性表达率，然后应用EGFP基因修饰的人AECs构建复层上皮细胞一角膜基质移植材料。手术切除兔眼的全部角膜缘组织制备角膜缘干细胞缺损动物模型，随机分为2组，实验组兔眼移植EGFP基因修饰的人AECs构建的复层上皮细胞一角膜基质移植材料，对照组兔眼移植无上皮细胞的角膜基质移植材料，每天裂隙灯下观察2组兔眼角膜的混浊、结膜上皮化和新生血管化情况。1个月后处死动物摘除眼球，荧光显微镜下观察角膜植片中EGFP的表达，用免疫组织化学法检测其细胞角蛋白8（CK8）、CKl8和CKl2的表达，以鉴定移植细胞分化为角膜样的上皮细胞。结果大多数转染细胞筛选出的抗性克隆以及培养的克隆细胞与正常体外培养的人AECs形态相似，流式细胞仪检测显示瞬时转染48h的人AECs中EGFP阳性表达率最高，为61．50％，与12、24、96h转染组15．24％、38．27％、39．10％比较差异均有统计学意义（P〈0．05），与72h转染组的58．36％比较差异无统计学意义（P〉0．05）。实验组10只兔眼中有6只眼角膜恢复透明，组织片在荧光显微镜下观察能发出绿色荧光，免疫组织化学结果显示CK8、CKl8、CKl2表达均为细胞质棕色染色，细胞核蓝染。对照组兔眼角膜均混浊、水肿，荧光显微镜下未见荧光，且部分角膜组织有CK8、CKl8表达，无CKl2表达。结论EGFP基因修饰的人AECs构建的复层上皮细胞一角膜基质移植材料能较好地重建角膜缘干细胞缺乏的兔眼角膜表层，可能是组织工程角膜表层一种新的细胞来源。慢病毒载体是一种安全有效的基因转移工具。

人羊膜上皮细胞侧脑室移植治疗脑出血大鼠实验研究

目的探讨人羊膜上皮细胞(hAECs)侧脑室移植对脑出血(ICH)大鼠脑水肿与神经功能恢复的影响。方法分离培养hAECs,用Hoechst33258和增强绿色荧光蛋白(EGFP)标记hAECs,将其移植入脑出血大鼠侧脑室中,测试大鼠28 d内的运动功能变化与脑水肿的动态变化,并行免疫组织化学观察。结果移植hAECs沿大鼠侧脑室壁生长,细胞存活4 w以上。巢蛋白(nestin)与波形蛋白(vim)免疫组化检测呈阳性表达,病灶周围小胶质细胞OX-42染色阳性细胞减少。移植组ICH大鼠脑含水量减少,神经功能明显改善。结论 hAECs移植到ICH大鼠侧脑室可存活,表达神经元特异性抗原,并减轻ICH大鼠脑水肿,改善运动功能。

人羊膜上皮细胞干细胞特性及向胰岛素分泌细胞分化的研究

目的建立人羊膜上皮细胞(hAECs)的分离及培养方法,探讨其向胰岛素分泌细胞分化的能力。方法观察不同培养方法对hAECs生长倍增时间的影响以优化其培养体系;通过细胞免疫荧光法检测不同培养代数细胞多能干细胞的表面标记;通过体外添加诱导因子的方法,探讨诱导hAECs向胰岛素分泌细胞分化的潜能。结果在10 ng表皮生长因子培养下,hAECs可长期传代。hAECs表达胚胎干细胞表面标记如阶段特异性胚胎抗原4等;采用悬浮培养法诱导分化,可检测到胰岛发育、胰岛功能基因如胰腺十二指肠同源盒、神经源素3、同源异形盒转录因子6、胰岛素、胰高糖素的表达,免疫组化检测细胞可以表达胰岛素,并且随着外界葡萄糖浓度升高,胰岛素分泌显著增加。结论建立了人羊膜上皮细胞的分离和培养方法(不添加动物血清);在体外可诱导分化为胰岛素分泌细胞。

人羊膜上皮细胞分化为成骨细胞的特性

背景:研究发现人羊膜上皮细胞系WISH和FC植入裸鼠体内均可分化成软骨和成骨,作者检索关于足月分娩人胎膜的羊膜上皮细胞是否具有成骨特性国内外报道少见。目的:以足月分娩胎膜的人羊膜上皮细胞为前体细胞,观察其在体外定向诱导条件下分化为成骨细胞的能力。设计、时间及地点:细胞分子水平检测,于2005-09/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成。材料:经产妇知情同意,无菌采集健康足月剖宫产胎盘6份,实验经医院医学伦理委员会批准。方法:采用机械法剥离胎盘羊膜组织,用胰蛋白酶消化法分离人羊膜上皮细胞,按3×108L-1密度接种进行原代培养。取第1代人羊膜上皮细胞,设立两组:诱导组以1×108L-1密度接种于培养皿内,24h后更换为含体积分数为0.1的胎牛血清、100nmol/L地塞米松、50mg/L抗坏血酸、5mmol/Lβ-甘油磷酸的诱导培养液。对照组换液成分为仅含体积分数为0.1的胎牛血清的LG-DMEM培养液。主要观察指标:原代细胞用流式细胞仪分析其表型,免疫细胞化学法检测细胞角蛋白19的表达。诱导后采用钙-钴法检测成骨细胞特异性碱性磷酸酶的表达,茜素红S检测钙盐沉积情况。结果:人羊膜上皮细胞表达间充质干细胞表面标志CD29、CD44和上皮细胞标志细胞角蛋白19。向成骨细胞诱导分化21后,人羊膜上皮细胞由圆形变成梭形、三角形,细胞胞浆内碱性磷酸酶呈阳性表达,且可见钙盐沉积。结论:源自足月分娩胎盘的人羊膜上皮细胞具有分化为成骨细胞的特性。

去细胞肌肉组织工程支架与人羊膜上皮细胞的相容性研究

目的制作去细胞肌肉组织工程支架,并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性。方法采用三硝基甲苯和十二烷基磺酸钠结合的化学萃取方法制作去细胞肌肉组织工程支架,冰冻切片观察其结构。将人羊膜上皮细胞种入支架培养7d后,用免疫组化检测羊膜上皮细胞的增殖活性、NT-3及BDNF的表达,扫描电子显微镜观察其超微结构。结果支架中细胞去除完全,其主要结构为平行排列的管状结构。细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完好。羊膜上皮细胞在支架里有增殖活性,并呈现NT-3、BDNF免疫反应阳性。扫描电镜显示,羊膜上皮细胞在支架中分布均匀,生长良好。结论成功的制作了去细胞肌肉组织工程支架,其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性。

人羊膜上皮干细胞对皮肤增生性瘢痕形成的作用

目的探讨人羊膜上皮细胞的干细胞对皮肤增生性瘢痕形成的作用。方法从足月分娩的人胎盘中剥离羊膜,采用胰蛋白酶消化法分离人羊膜上皮干细胞(human amniotic epithelial stem cells,hAECs),并在体外使用含表皮生长因子的LG-DMEM培养基进行培养,利用免疫荧光染色、流式细胞术和定向诱导等鉴定人羊膜上皮细胞的干细胞特性。构建兔耳全层皮肤缺损模型,左耳创面注射磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照组,右耳创面注射羊膜上皮细胞悬液为实验组。结果实验中hAECs表达干细胞标志物SSEA-4和OCT-4,并表达间充质干细胞表面标记物,具有多向分化潜能。1个月后,兔子右耳瘢痕比左耳瘢痕薄,HE染色示:移植干细胞组有效的抑制了增生性瘢痕的形成,纤维化面积较小。在激光共聚焦细胞仪下可发现移植的hAESCs存活。结论人羊膜上皮细胞可以促进创面愈合,减少炎症反应,有效抑制兔耳创面瘢痕的形成。这可能成为瘢痕预防和治疗的新手段和切入点。