Has_circ_0008717在羊膜间充质干细胞上清促血管生成中的作用研究

目的:探究has_circ_0008717在人羊膜间充质干细胞上清(hAMSC-CM)促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管生成过程中的作用。方法:通过划痕实验、Transwell实验及成管实验检测hAMSC-CM对HUVECs迁移及成管能力的影响,实时荧光定量RT-PCR筛选上调的circRNA(has_circ_0008717);小干扰RNA(siRNA)下调HUVECs内has_circ_0008717水平后,实时荧光定量RT-PCR检测血管内皮生长因子A(VEGFA)表达水平变化,划痕实验、Transwell实验及成管实验观察其对hAMSC-CM促进HUVECs迁移及成管的影响。结果:hAMSC-CM可明显促进HUVECs迁移及成管能力(P<0.05),HUVECs中has_circ_0008717升高最为明显(P<0.05),而敲低has_circ_0008717可明显抑制hAMSC-CM促进HUVECs迁移、成管和VEGFA的表达(P<0.05)。结论:hAMSC-CM可通过has_circ_0008717增强HUVECs的成管能力。

不同体积分数氧气预处理人羊膜间充质干细胞的生物学特性

背景:近年来,干细胞在组织损伤修复中发挥着重要作用,其中间充质干细胞移植应用最为广泛,间充质干细胞可以通过旁分泌细胞因子促进损伤组织的修复,低氧预处理可以改善间充质干细胞的生物学特性,因而,低氧预处理的人羊膜间充质干细胞可能在组织损伤修复中起到更好的治疗作用。目的:探讨不同体积分数氧气预处理对人羊膜间充质干细胞增殖、抗凋亡能力、旁分泌作用的影响。方法:利用酶消化法获得原代人羊膜间充质干细胞,将第3代人羊膜间充质干细胞通过不同体积分数氧气进行预处理48 h,随机分为1%,3%,5%,10%低氧预处理组和常氧对照组体积分数21%氧气,倒置显微镜下观察人羊膜间充质干细胞的形态,CCK-8检测人羊膜间充质干细胞的增殖能力,Annexin V-FITC/PI试剂盒检测人羊膜间充质干细胞的凋亡情况,实时定量PCR法检测人羊膜间充质干细胞凋亡基因和缺氧诱导因子的表达,酶联免疫吸附法检测人羊膜间充质干细胞分泌的细胞因子水平。结果与结论:显微镜下观察不同体积分数氧气预处理组人羊膜间充质干细胞的形态无明显差异,低氧预处理能提高人羊膜间充质干细胞的增殖、抗凋亡和旁分泌细胞因子的能力,且体积分数1%氧气预处理效果优于体积分数3%,5%,10%,21%氧气预处理。

低氧预处理人羊膜间充质干细胞来源外泌体在改善血管衰老中的作用研究

目的明确低氧预处理人羊膜间充质干细胞来源的外泌体(human amniotic mesenchymal stem cell⁃derived exosomes,hAMSC⁃exos)是否在改善血管衰老中发挥作用。方法D⁃半乳糖(D⁃galactose,D⁃gal)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)亚急性衰老,收集低氧预处理hAMSC⁃exos作用于D⁃gal诱导衰老的HUVEC,通过衰老相关β⁃半乳糖苷酶(senescence⁃associatedβ⁃galactosidase,SA⁃β⁃Gal)活性染色,P53、P16和γH2AX蛋白表达水平测定HUVEC的衰老水平变化,通过划痕实验、transwell小室迁移实验和成管实验来检测HUVEC的成血管功能变化。结果D⁃gal诱导能够成功构建HUVEC亚急性衰老模型;SA⁃β⁃Gal检测及P53、P16和γH2AX蛋白表达检测显示低氧预处理hAMSC⁃exos可更好地逆转D⁃gal诱导HUVEC导致的SA⁃β⁃Gal、P53、P16和γH2AX上调;划痕实验、transwell小室迁移实验和成管实验结果显示,低氧预处理hAMSC⁃exos可改善D⁃gal诱导的HUVEC的成血管功能下调。结论本研究初步明确了低氧预处理hAMSC⁃exos能改善HUVEC的衰老表型。

下调NF-κB信号通路促进人羊膜间充质干细胞上皮化

目的探讨NF-κB信号通路在诱导人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)上皮化的过程中发挥的作用。方法分离和培养hAMSCs,将hAMSCs分为对照组和诱导组(n=3),采用RT-qPCR检测上皮化标志物(CK-7、CK-19、E-cadherin)、间质标志物(Vimentin)、NF-κB信号通路关键因子(IκBα、p65)和NF-κB信号通路靶基因cyclin D1的mRNA表达水平;采用免疫荧光检测CK-7、E-cadherin、Vimentin、IκBα、p65和p-p65的蛋白表达水平;为确认NF-κB信号通路在hAMSCs上皮化中的作用,将hAMSCs分为诱导组、抑制剂组、Ad-GFP组(空白腺病毒)、Ad-IκBα组(腺病毒过表达IκBα)、LV-GFP组(空白慢病毒)、LV-RELA-RNAi组(慢病毒沉默p65)(n=3)。RT-qPCR检测CK-7、CK-19、E-cadherin、Vimentin、IκBα和p65的mRNA表达水平,免疫荧光检测CK-7、E-cadherin、Vimentin和IκBα、p65、p-p65的蛋白表达水平。结果与对照组比较,诱导组中CK-7、CK-19、E-cadherin的mRNA表达升高(P<0.01),CK-7、E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05),Vimentin的mRNA表达降低(P<0.01),蛋白表达降低(P<0.05),IκBα、p65、cyclin D1的mRNA表达降低(P<0.001),IκBα、p65、p-p65蛋白表达降低(P<0.05);抑制剂组、Ad-IκBα组、LV-RELA-RNAi组中CK-7、CK19、E-cadherin的mRNA表达较诱导组明显升高(P<0.01),CK-7、E-cadherin蛋白表达较诱导组升高(P<0.05),Vimentin的mRNA表达明显下降(P<0.01),蛋白表达降低(P<0.05)。结论NF-κB信号通路参与hAMSCs上皮化的调控,下调NF-κB信号通路能有效促进hAMSCs上皮化。

人羊膜间充质干细胞在女性生殖系统的应用前景

人羊膜间质干细胞具有来源广泛、对供体无创伤、低免疫原性、无明显致瘤性、多种分化潜能的特点,其通过趋化作用到达目标组织,同时能分泌多种细胞因子,具有抗炎、抗纤维化、促进组织修复和再生的功能。女性卵巢功能减退会导致排卵异常、生殖激素分泌不足等,而子宫内膜基底层受损导致自身修复不良,从而造成生殖系统病变。目前临床上的常规治疗方法并不能满足患者的生育需求,多项研究表明,人羊膜间充质干细胞在女性生殖领域具有较好的应用前景。本文总结人羊膜间充质干细胞的生理特性,探讨其在女性生殖的应用前景。

高表达血管紧张素转化酶2的羊膜间充质干细胞对肺动脉高压大鼠的干预作用

目的观察转染血管紧张素转换酶2(ACE2)基因的人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)对野百合碱诱发的肺动脉高压(PAH)大鼠模型的干预作用。方法(1)用携带ACE2基因的慢病毒转染hAMSCs,检测转染前后hAMSCs中ACE2、胰岛素样生长因子(IGF-1)、粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)基因的表达、细胞迁移以及成管能力的变化。(2)实验动物选用雄性、健康、6周龄SD大鼠,随机分为正常对照组(Control组)、肺动脉高压组(PAH组)、人羊膜间充质干细胞治疗组(hAMSCs组)以及转染ACE2的人羊膜间充质干细胞治疗组(ACE2-hAMSCs组)。造模成功2周后测量平均肺动脉压力(mPAP)、右心室肥厚指数(RVHI),肺组织HE染色观察肺小动脉管腔大小以及血管壁的厚薄变化,QPCR测定了肺组织中GCP-2、ACE2、α-肌动蛋白(α-actin)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)mRNA的表达水平。结果体外细胞实验显示ACE2-hAMSCs较单纯的hAMSCs组的细胞迁移能力、成管能力提高(P<0.05)。ACE2-hAMSCs上调了ACE2及促血管生成因子IGF-1、GCP-2 mRNA表达(P<0.01)。干预处理2周后,PAH组的mPAP、RV/LV+S较正常对照组升高(P<0.01),与PAH组及hAMSCs组比较,ACE2-hAMSCs组的mPAP、心脏RV/LV+S下降(P<0.01)。与PAH组相比,ACE2的mRNA表达水平在ACE2-hAMSCs组的肺组织中明显升高。结论ACE2-hAMSCs能够降低野百合碱(MCT)诱导的PAH大鼠模型的肺平均动脉压力,改善肺血管及右心室重塑,其治疗作用优于hAMSCs组,考虑可能一方面与ACE2-hAMSCs促进hAMSCs的旁分泌作用,促进促血管生长因子GCP2、IGF-1表达,修复损伤的肺血管内皮细胞,减轻肺动脉高压力有关,另一方面与hAMSCs中高表达的ACE2调节RAS有关。

人参皂苷Rg1联合人羊膜间充质干细胞移植治疗卵巢功能不全的效用及机制

目的:评估人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)联合人羊膜间充质干细胞(hAD-MSCs)移植治疗卵巢功能不全(POI)的疗效优势。方法:共使用40只大鼠,随机分为对照(Control)组、模型(Model)组、单纯hAD-MSCs治疗(hAD-MSCs)组和hAD-MSCs联合Rg1治疗(hAD-MSCs+Rg1)组,每组10只,其中5只用于采集卵巢和血液等组织样本,另5只进行卵母细胞诱导和卵母细胞线粒体功能测定相关实验。模型组构建放疗辐射诱导的POI大鼠模型。结果:与Control组相比,Model组大鼠卵巢存在较大程度的卵泡耗竭和器质性病变,初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡和排卵前卵泡均减少,卵巢指数下降,血清FSH升高,E2降低,卵巢组织TUNEL阳性细胞数量增加,ROS水平上升,卵母细胞线粒体膜电势降低,ATP生成量减少(P<0.05)。与单纯hAD-MSCs组相比,hAD-MSCs+Rg1联合组POI大鼠卵巢组织卵泡耗竭和器质性病变明显缓解,初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡和排卵前卵泡明显增加,卵巢指数回升显著,血清FSH降低,E2回升,卵巢组织TUNEL阳性细胞数量明显下降,ROS水平明显降低,卵母细胞线粒体膜电势回升,ATP生成量回升显著(P<0.05)。结论:Rg1通过增强hAD-MSCs移植改善卵母细胞线粒体功能的机制并缓解POI大鼠模型疾病进展。

人羊膜间充质干细胞的研究进展

人羊膜间充质干细胞(hAMSC)具有来源丰富、分离简单的优点。hAMSC在组织修复中具有支持造血、再生、免疫调节、抗纤维化等作用。本文对羊膜间充质干细胞在各个系统疾病治疗的研究进行了综述,旨在为羊膜间充质干细胞的应用提供参考。

人羊膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞的生物学特性及免疫抑制作用的比较

目的:比较人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSC)与骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,h BMM SC)的生物学特性及对异体外周血淋巴细胞的免疫抑制功能。方法:通过形态学观察、生长曲线绘制、细胞周期检测、细胞表型鉴定、免疫荧光检测波形蛋白(vimentin)等方法对h AMSC和h BMM SC的生物学特性进行鉴定与比较。建立M SC与外周血单个核细胞(PBM C)共培养体系,采用CCK-8法比较两种不同共培养体系中淋巴细胞的增殖水平,采用ELISA法比较两种MSC共培养体系中细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)的分泌水平。结果:h AMSC与h BMMSC细胞形态相似,h AMSC可传至15代以上,h BMMSC传至第6-7代则开始老化、增殖能力明显减弱。两种细胞G2/M期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。免疫表型鉴定为:h AM SC和h BMM SC细胞表面均表达CD105、CD90和CD73,均不表达CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR,h AM SC表达Oct-3/4,而h BMM SC不表达;两者均表达波形蛋白(vimentin)。h AM SC和h BMM SC均对PHA刺激的PBM NC增殖具有抑制作用,且随着h AM SC和h BMM SC细胞比例的增高,抑制能力增强,二者无统计学差异(P>0.05)。ELISA结果提示,h AM SC+PBM C+PHA共培养组上清中IFN-γ水平较h BMM SC+PHA+PBM C组低(P>0.05),两者分别与PBM C+PHA组上清比较,IFN-γ水平明显降低(P<0.05)。结论:h AM SC比h BMM SC具有更强的增殖能力和干细胞特性,二者均有免疫抑制功能,h AMSC与h BMMSC在体外均能抑制PHA刺激的异体淋巴细胞增殖并减少其IFN-γ的分泌。

人羊膜间充质干细胞在大鼠受损肝组织中分化为肝细胞

背景:羊膜间充质干细胞在体外适当的诱导条件下可分化为肝细胞样细胞,而在受损肝脏原位是否可分化为肝细胞值得探讨。目的:观察人羊膜间充质干细胞在大鼠肝损伤原位植活及分化情况。方法:采用胰酶-胶原酶二酶消化法从羊膜组织中分离人羊膜间充质干细胞。采用腹腔注射D-氨基半乳糖建立大鼠肝损伤模型,随机分为2组,人羊膜间充质干细胞移植组造模后注射L-DMEM悬浮的人羊膜间充质干细胞悬液,对照组注射等量L-DMEM。结果与结论:①FCM分析结果显示,所分离的人羊膜间充质干细胞表达CD29、CD44和CD166;免疫荧光染色显示人羊膜间充质干细胞表达波形蛋白,不表达CK19。②与对照组比较,人羊膜间充质干细胞移植后肝病理无明显差异,均呈急性肝坏死病理改变。③免疫荧光双染色结果显示,人羊膜间充质干细胞移植后1周主要定植于肝小叶且表达CK19,至2周表达CK18,至3周表达Alb。结果表明,人羊膜间充质干细胞在大鼠受损肝组织中能被植活,且可分化为肝细胞,提示人羊膜间充质干细胞移植在临床肝病的治疗方面可能具有潜在应用价值。

血管内皮生长因子基因修饰人羊膜间充质干细胞利于超长随意皮瓣的成活

背景:研究证实血管内皮生长因子能够诱导新生血管形成,人羊膜间充质干细胞也可通过多种机制改善皮瓣移植的缺血再灌注损伤。因此,用血管内皮生长因子基因修饰人羊膜间充质干细胞为促进皮瓣成活提供了可能。目的:探索局部应用血管内皮生长因子基因修饰人羊膜间充质干细胞对超长比例随意皮瓣成活的影响。方法:将30只成年SD大鼠随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,每组10只,在其背部左右分别构建2 cm×8 cm超长缺血随意皮瓣模型,皮瓣蒂部位于髂棘水平,分别为Ⅰ-left,Ⅰ-right,Ⅱ-left,Ⅱ-right,Ⅲ-left,Ⅲ-right。皮瓣掀起后即刻,Ⅰ-left、Ⅱ-left注射0.5m LLG-DMEM培养基划分为对照组,Ⅰ-right、Ⅲ-left注射0.5m L细胞浓度为1×10~9 L^(-1)的人羊膜间充质干细胞悬液划分为实验组1,Ⅱ-right、Ⅲ-right注射0.5 mL细胞浓度为1×109L-1转染血管内皮生长因子基因的人羊膜间充质干细胞悬液划分为实验组2,每个皮瓣共注射5点,每点注射0.1m L。移植后即刻、24,48h以及4,7d,激光多普勒血流监测仪监测皮瓣中部和蒂部的血流灌注值,移植后7d观察各组皮瓣的成活率,取成活皮瓣组织通过组织学观察各组皮瓣毛细血管密度,荧光显微镜观察人羊膜间充质干细胞在皮瓣内的分布及存活状况,Westernblot检测皮瓣组织中血管内皮生长因子蛋白水平。结果与结论:①实验组2皮瓣成活率、血流灌注值、皮瓣毛细血管密度明显高于实验组1及对照组,实验组1皮瓣成活率、血流灌注值、皮瓣毛细血管密度明显高于对照组,差异有显著性意义(P <0.05);②在荧光显微镜下观察发现,实验组1、实验组2皮瓣组织内有CM-Dil标记的人羊膜间充质干细胞;③各组皮瓣组织血管内皮生长因子蛋白表达均呈阳性,实验组2皮瓣组织血管内皮生长因子蛋白表达明显高于实验组1及对照组,实验组1皮瓣组织血管内皮生长因子蛋白表达明显高于对照组,差异有显著性意义(P <0.05);④结果证实,在超长随意皮瓣中、远部位应用人羊膜间充质干细胞可明显改善皮瓣成活率;人羊膜间充质干细胞经血管内皮生长因子基因转染后能够分泌更多的血管内皮生长因子蛋白,进而促进超长随意皮瓣血管新生,提高皮瓣成活率。

人羊膜间充质干细胞对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的疗效及免疫调节作用

目的探讨人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型的治疗效应和免疫调节作用。方法分离、培养hAMSCs,流式细胞术(FCM)检测其免疫表型;用豚鼠脊髓匀浆+完全弗氏佐剂+百日咳毒素复制大鼠EAE模型;模型动物随机分为正常对照组、模型组、培养基组、hAMSCs治疗组和泼尼松治疗组,每组6只。hAMSCs治疗组经双侧侧脑室移植5×105个hAMSCs;采用Kono评分法动态观察行为学变化;采用HE染色、免疫荧光染色观察脑和脊髓病理改变以及hAMSCs在脑和脊髓内的分布;采用FCM检测外周血淋巴细胞亚群,采用流式微球阵列法(CBA)检测血浆细胞因子的含量。结果 hAMSCs治疗后EAE大鼠行为学评分逐渐减低(P<0.01),脑和脊髓炎性细胞浸润减轻。hAMSCs移植第3周,大鼠脑和脊髓组织可见较多人细胞核抗原阳性细胞即hAMSCs存活;与模型组和培养基组相比,hAMSCs治疗组外周血Treg、Th2、Tc1、Tc2淋巴细胞百分比明显升高(P<0.01或P<0.05),而Th17细胞显著减少(P<0.01);血浆Th2型细胞因子IL-4和IL-10含量升高(P<0.05或P<0.01),而Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ含量降低(P<0.05或P<0.01)。结论 hAMSCs能改善大鼠EAE的神经功能,减轻神经组织的免疫损伤,其机制可能主要与上调FoxP3+Treg细胞和下调Th17细胞有关。

人羊膜间充质干细胞移植对阿尔茨海默病转基因小鼠的行为学和β-淀粉样蛋白的影响

背景:研究发现APP基因与阿尔茨海默病发病密切相关。β-淀粉样蛋白是阿尔茨海默病患者脑内老年斑的主要成分,基因突变和外界环境的影响能破坏β-淀粉样蛋白的动态平衡,从而引发或加速阿尔茨海默病的产生和发展。目的:探讨人羊膜间充质干细胞尾静脉移植对阿尔茨海默病转基因小鼠学习记忆能力及脑组织β-淀粉样蛋白表达的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-05/10在郑州大学微生物学与免疫学教研室和河南省中医药治疗研究院完成。材料:健康剖宫产产妇志愿捐献的羊膜,由郑州大学第一附属医院产科提供。APP转基因鼠29只,PCR技术鉴定转APP-基因小鼠9只,作为正常组;转APP+基因小鼠20只,随机分为细胞移植组、对照组,10只/组。方法:无菌条件下体外分离培养人羊膜间充质干细胞,传至第3代将细胞浓度调整为1×109L-1,经尾静脉注入0.5mL至细胞移植组小鼠体内;对照组经尾静脉注入同体积的生理盐水;正常组小鼠不给予任何干预措施。主要观察指标:采用Morris水迷宫测定小鼠逃避潜伏期、穿越平台次数及在平台象限的时间,刚果红染色观察小鼠脑组织内β-淀粉蛋白的表达。结果:定位航行试验中,移植前与正常组比较,细胞移植组、对照组小鼠逃避潜伏期差异均有显著性意义(P<0.05);移植后2周细胞移植组小鼠逃避潜伏期与正常组基本相似(P>0.05),但明显短于对照组(P<0.05)。空间探索试验中,移植前后小鼠穿越平台次数及其在平台象限的时间3组间比较差异均无显著性意义(P>0.05)。移植后1个月,正常组未见或仅见极少量的β-淀粉样蛋白沉积,细胞移植组淀粉样蛋白的沉积明显少于对照组。结论:人羊膜间充质干细胞尾静脉移植能促进阿尔茨海默病转基因小鼠空间定位及学习记忆能力的提高,且减少小鼠脑内β-淀粉样蛋白的沉积。

体外定向诱导人羊膜间充质干细胞向骨、软骨及脂肪细胞的分化

背景:人羊膜间充质干细胞属于成体干细胞,在体外不同条件下诱导分化为骨、软骨及其他结缔组织,较其他类型间充质干细胞,因其来源广泛,分离无创伤,较低的免疫原性、生长周期短等特点,是组织工程种子细胞的重要来源。目的:探讨人羊膜间充质干细胞是否具有间充质干细胞特性及诱导成骨、软骨及脂肪细胞诱导分化的能力。方法:取足月产胎盘羊膜组织,酶消化法分离人羊膜间充质干细胞,取第3代细胞分别加入成骨、成软骨及成脂诱导液的培养基进行诱导。结果与结论:(1)茜素红染色显示,成骨诱导后细胞存在多个矿化结节,细胞中碱性磷酸酶活性明显增加;(2)甲苯胺蓝染色显示,成软骨诱导后细胞基质中分泌大量的糖胺聚糖;(3)油红O染色显示,成脂诱导后,细胞浆内可见脂滴;(4)实时荧光PCR结果显示,成骨、成软骨及成脂诱导21 d后,相关基因表达较7 d时明显增高;(5)结果人羊膜间充质干细胞具有向成骨细胞,软骨细胞及脂肪细胞的潜能,可选作为组织工程学的种子细胞。

人羊膜间充质干细胞静脉移植治疗阿尔茨海默病APP^+转基因鼠的有效性及安全性评估

背景:目前阿尔茨海默病的病因不明,课题组前期实验发现人羊膜间充质干细胞静脉移植可促进阿尔茨海默病APP+转基因鼠的学习、记忆能力改善。目的:进一步评估人羊膜间充质干细胞静脉移植治疗阿尔茨海默病APP+转基因鼠的有效性和安全性。设计、时间及地点:细胞学体内实验与动物对照观察,于2008-05/12在郑州大学生物工程系、郑州大学基础医学院及河南省中医药研究院完成。材料:清洁级C57BL/6系APP+转基因胎鼠10只,合笼繁育后得到子代小鼠200只,按其繁殖情况和PCR检测结果,取29只11月龄小鼠,分为APP+对照组10只、APP+细胞移植组10只、APP-正常组9只。羊膜标本由郑州大学第一附属医院产科提供。方法:体外分离培养人羊膜间充质干细胞,传至第3代后调整浓度为1×109L-1的单细胞悬液。APP+细胞移植组每只小鼠尾静脉注射人羊膜间充质干细胞悬液0.5mL,APP+对照组注射等量生理盐水,APP-正常组不作任何处理。主要观察指标:采用Morris水迷宫测定移植前后小鼠学习和记忆功能。移植当天开始称小鼠体质量,持续3周。移植后解剖小鼠,收集全血并分离血清,进行12项肿瘤标记物检测及心、肝、肾功能的血液生化指标检测,对人羊膜间充质干细胞移植的安全性作综合评价。结果:移植后15d各组逃避潜伏期比较,APP-正常组<APP+细胞移植组<APP+对照组,APP+细胞移植组小鼠逃避潜伏期明显短于APP+对照组(P<0.05);与移植前比较,移植后15d各组小鼠穿越平台象限的次数均有所增加,且APP+细胞移植组小鼠在平台象限停留时间明显延长。移植后3周内,3组小鼠体质量增长趋势差异无显著性意义(P>0.05),12项肿瘤标记物、9项血清肝肾功能生化指标及10项血液学指标的表达均无明显差异(P>0.05)。结论:人羊膜间充质干细胞经尾静脉移植后,可明显改善阿尔茨海默病小鼠的学习、记忆能力,未见致死致瘤现象发生,心、肝、肾功能未受影响,安全可行。

人羊膜间充质干细胞的分离及分化潜能的研究

目的建立人羊膜间充质干细胞(hAMC)的分离培养方法及探讨其在再生医学中的潜在应用性。方法取38～40周孕妇剖宫产术后人羊膜,用多种酶消化法制备hAMC悬浮液,并用免疫细胞化学方法探讨其多分化潜能如hAMC的神经及肝脏发生相关蛋白的表达;荧光激活细胞仪分离法(FACS)检测主要组织相容性复合体(MHC)家族分子,同时探讨其致瘤性。结果从人羊膜中分离出高纯度hAMC,并摸索出其最适合的培养条件;细胞成细长梭形或星形,胞质丰富,细胞核呈圆形,1～3个核仁,易贴壁,生长繁殖快,在体外可连续培养20代以上。免疫细胞化学结果显示:神经发生相关蛋白(Musashi-1、Nestin、Vimentin)阳性及肝脏发生相关蛋白[Flt-1、Integrinβ1、HNF(3β、4α、1α)、C/EBPα、Albumin、AAT]等阳性;人MHC ClassⅡ阴性,人MHC ClassⅠ弱阳性;癌化实验显示hAMC无致瘤性。结论人羊膜中分离提纯的hAMC中至少包含向神经及肝脏细胞分化的干细胞样的细胞群,具有低免疫原性、无致瘤性等特点。这些结果支持hAMC作为新的、安全的细胞来源可用于再生医学研究。

人羊膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞对外周血淋巴细胞的免疫调节作用比较

目的比较人羊膜间充质干细胞(h AMSC)与骨髓间充质干细胞(h BMSC)对异体外周血淋巴细胞的免疫调节功能,为临床应用h AMSC治疗移植物抗宿主病提供实验依据。方法通过酶消化法和Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分别分离出人羊膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞,体外扩增培养间充质干细胞(MSC),获取第4代细胞,建立MSC与经植物血凝素(PHA)刺激的异体人外周血单个核细胞(PBMC)共培养体系,采用流式细胞术分析比较两种不同共培养体系中T淋巴细胞亚群的变化情况,采用ELISA法比较两种MSC共培养体系中细胞因子白介素2(IL-2)及白介素10(IL-10)的分泌水平。结果 (1)h AMSC+PBMC+PHA、h BMSC+PBMC+PHA共培养组Treg、Th2、Tc2细胞亚群的比例均较PBMC+PHA组明显上升(P<0.05),Th1、Tc1细胞亚群的比例均较PBMC+PHA组明显下降(P<0.05),且h AMSC+PBMC+PHA、h BMSC+PBMC+PHA共培养组T细胞亚群的变化差异无统计学意义(P>0.05);(2)ELISA结果提示,与PBMC+PHA组相比,h AMSC+PBMC+PHA、h BMSC+PHA+PBMC共培养组上清液中IL-2的水平均明显下降(P<0.05),h AMSC+PBMC+PHA、h BMSC+PHA+PBMC共培养组上清液中IL-10水平均明显上升(P<0.05),h AMSC+PBMC+PHA、h BMSC+PBMC+PHA共培养组上清液中IL-2、IL-10含量的变化无统计学差异(P>0.05)。结论 h AMSC、h BMSC对外周血淋巴细胞具有相似的免疫调节功能,提示h AMSC可能为移植物抗宿主病的预防和治疗提供一种新的选择。

量子点标记神经生长因子纳米化颗粒修饰羊膜间充质干细胞移植治疗大鼠实验性脑损伤

目的：量子点是由Ⅱ-Ⅵ族元素或Ⅲ-V族元素组成的纳米颗粒,因三维上受到量子限制而表现出独特的光学特征,其标记的神经生长因子纳米化颗粒由于是纳米级,易通过细胞生物膜。实验观察负载此纳米颗粒的羊膜间充质干细胞移植治疗大鼠脑损伤的效果。方法：实验于2007-01/10在郑州大学完成。①材料：SPF级健康成年Wistar大鼠40只,按体质量编号分为4组：神经生长因子细胞组、常规细胞组、损伤模型组、培养基对照组,10只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。羊膜间充质干细胞来自健康产妇胎盘羊膜,产妇对实验知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准。量子点神经生长因子纳米粒由兰州大学功能有机分子化学国家重点实验室协助构建。②实验方法：向羊膜间充质干细胞中加入含10%胎牛血清、20μg/L碱性成纤维生长因子的DMEM/F12培养基,置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,待细胞达80%～90%融合时胰酶消化传代。取传至第3代细胞,分别加入终浓度为20,40,60μg/L的量子点标记神经生长因子纳米粒进行修饰处理72h,并设立空白对照和空载量子点对照。4组大鼠均采用Feeney自由落体法建立脑损伤模型,神经生长因子细胞组于大鼠损伤部位注入经40mg/L量子点标记神经生长因子纳米粒修饰的羊膜间充质干细胞悬液10μL（约4.0×10^8个细胞）,常规细胞组注入等量单纯量子点标记的羊膜间充质干细胞悬液,培养基对照组注入等量DMEM/F12细胞培养基,损伤模型组不给予移植操作。③实验评估：经量子点标记的神经生长因子纳米粒修饰后,MTT法检测细胞活性,荧光显微镜观察量子点在细胞内的分布,免疫细胞化学鉴定细胞分化。细胞移植后对各组大鼠运动及感觉功能进行评分,免疫组织化学染色及荧光显微镜观察量子点荧光化羊膜间充质干细胞在脑内存活分化和迁移情况。结果：①细胞生长率：培养72h后与空白对照和空载量子点对照细胞比较,20,40,60μg/L量子点标记的神经生长因子纳米粒组细胞生长率均呈增长趋势,40μg/L时细胞无明显生长抑制,达60μg/L时增长有所减慢。②体外量子点分布：荧光显微镜连续观察羊膜间充质干细胞,约6h后开始摄入量子点标记的神经生长因子纳米粒,随着时间延长摄入量逐渐增加,于32h荧光强度达高峰。③体外免疫细胞化学鉴定：经量子点神经生长因子纳米粒修饰的羊膜间充质干细胞表达神经元烯醇化酶和神经丝蛋白,向神经元方向分化,但不表达胶质纤维酸性蛋白。④神经行为学检测结果：细胞移植后24h,各组神经行为学各项指标评分均基本相似（P〉0.05）;移植后10,20d,损伤模型组与培养基对照组无明显变化,神经生长因子细胞组、常规细胞组运动及感觉功能各项评分均显著降低（P〈0.05）,且神经生长因子细胞组下降幅度明显强于常规细胞组（P〈0.05）。⑤免疫组织化学和荧光检测结果：经量子点神经生长因子纳米粒修饰的羊膜间充质干细胞在脑组织损伤区存活,并向周围迁移。结论：量子点是一种较好的细胞示踪剂,负载其标记的神经生长因子纳米化颗粒的羊膜间充质干细胞移植能够改善脑损伤大鼠神经功能。

人羊膜间充质干细胞原位移植治疗大鼠脑梗死

背景:前期实验研究发现,移植人羊膜间充质干细胞能有效改善脑梗死大鼠的神经损伤症状。目的:观察移植人羊膜间充质干细胞在大鼠脑梗死区域的存活、定植和分化情况。方法:将60只SD大鼠随机分为3组,实验组、模型组采用线栓法制作大脑中动脉闭塞模型,假手术组只结扎血管,不插入线栓;造模后1 d,实验组于受损纹状体和皮质两点原位植入10μL第3代人羊膜间充质干细胞悬液(含细胞2×106/只),模型组与假手术组于相同部位注射等体积PBS。移植后1周连续监测体质量并进行神经缺损严重程度评分;移植后2周,TTC染色观察脑梗死面积,苏木精-伊红染色观察脑组织病理学变化,免疫荧光染色检测移植大鼠大脑神经细胞标志物神经元特异性核蛋白的表达。结果与结论:(1)体质量与神经缺损严重程度评分:与假手术组比较,模型组、实验组体质量呈下降趋势,实验组降低少于模型组,但差异无显著性意义;模型组、实验组神经功能缺损评分随时间呈逐渐降低趋势,但实验组评分明显低于模型组;(2)脑梗死面积:模型组大脑皮质出现局灶性缺血坏死且范围较大,与模型组比较,实验组缺血灶面积明显缩小;(3)脑组织病理:实验组梗死病灶范围、神经细胞及炎细胞浸润均少于模型组;(4)免疫荧光染色:移植后1周,实验组脑组织可见较多的移植人羊膜间充质干细胞,2周后可见移植的人羊膜间充质干细胞向神经样细胞分化;(5)结果表明:人羊膜间充质干细胞移植可在大鼠脑梗死区域定植、存活,且在原位能分化为神经样细胞。

人羊膜负载人羊膜间充质干细胞对SD大鼠皮肤创面愈合的影响

目的观察人羊膜(HAM)负载人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)对SD大鼠皮肤创面愈合的影响。方法采用胰酶消化HAM的上皮细胞,将hAMSCs接种于HAM上培养,然后贴覆于大鼠创面,观察创面大体变化,采用HE染色和免疫组织化学染色法检测创面愈合情况,并与单纯羊膜组和对照组进行比较。结果 HAM负载hAMSCs组大鼠创面的平均愈合时间为(18.3±0.9)d,明显快于对照组的(26.4±0.7)d(P<0.01)和单纯羊膜组的(21.5±1.2)d(P<0.05);术后11 d和14 d,HAM负载hAMSCs组大鼠的创面愈合率分别为(81.5±7.2)%和(94.3±3.6)%,明显高于对照组的(48.5±3.2)%和(74.3±4.3)%及单纯羊膜组的(68.5±4.5)%和(86.8±4.8)%(P均<0.01)。皮肤切片HE染色结果证实,HAM负载hAMSCs组大鼠的伤口愈合质量明显优于单纯羊膜组和对照组。免疫组织化学染色结果显示,术后14 d,HAM负载hAMSCs组大鼠皮肤CK19阳性表皮干细胞数为48.2±3.2,明显高于单纯羊膜组的37.7±3.1(P<0.05)和对照组的29.6±2.4(P<0.01);血管内皮生长因子阳性颗粒表达数为64.5±4.5,也明显高于单纯羊膜组的52.6±3.8(P<0.05)和对照组的40.7±3.1(P<0.01)。结论 HAM负载hAMSCs可能是通过促进表皮干细胞和毛细血管再生,促进皮肤损伤修复。