HPLC测定美伐他汀发酵液中的有效成份

目的建立测定美伐他汀发酵液中有效成分美伐他汀酸和美伐他汀酯含量的方法。方法采用HPLC法,EclipseXDB-C18色谱柱,流动相为0.1%磷酸水溶液-乙腈(30:70),流速0.8 ml.min-1;柱温30℃;检测波长238 nm;进样量10μl。结果美伐他汀酸和美伐他汀酯0.005~0.500 mg.ml-1线性关系良好,r分别为0.9998和0.9999;回收率为99.8%~100.1%。结论所建方法具有简单快速、高效灵敏、回收率高、重复性好等优点,为发酵液效价的质量控制提供了依据。

过表达veA对橘青霉美伐他汀生物合成的影响

在丝状真菌中,全局性调控因子VeA广泛存在并高度保守,调节多个次级代谢基因簇和生长发育.在橘青霉中克隆veA的基础上,通过农杆菌介导的转化获得了OE∷veA菌株.结果显示:veA过表达后,分生孢子产量下降61%,美伐他汀产量提高3倍.光照能促进橘青霉中veA的表达从而抑制橘青霉生长发育.这些结果提示在橘青霉中veA和孢子形成、美伐他汀合成密切相关.

美伐他汀诱导人非小细胞肺癌细胞凋亡及其分子机制的研究

目的:研究美伐他汀对非小细胞肺癌细胞(nod-small-cell lung cancer,NSCLC)诱导凋亡及其分子机制。方法:应用MTT法检测美伐他汀对A549、NCI-H520细胞株的体外增殖作用,应用流式细胞仪,透射电镜,研究美伐他汀对A549、NCI-H520细胞株的细胞周期阻滞和诱导调亡的作用,应用流式细胞术和RT-PCR检测P21蛋白、P21 mRNA、XIAP mRNA的表达,以研究细胞周期阻滞和诱导调亡的机制。结果:MTT试验表明:美伐他汀对A549、NCI-H520增殖有明显的抑制作用,且表现为剂量依赖性和时间依赖性;流式细胞学显示:美伐他汀诱导A549、NCI-H520细胞G0／G1期阻滞;Annexin V结果证实美伐他汀可诱导A549、NCI-H520细胞凋亡,而且凋亡率随剂量的增加而增加。美伐他汀对A549、NCI-H520细胞P21 mRNA及P21总蛋白的表达无影响,但可使P21细胞膜蛋白的表达下降。美伐他汀作用后XIAP mRNA的表达下降,加入外源性甲羟戊酸可完全逆转美伐他汀的上述作用。结论:美伐他汀通过抑制甲羟戊酸合成途径诱导NSCLC细胞G0／G1阻滞,抑制增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与抑制P21蛋白异戊二烯化和下调XIAP mRNA的表达有关。

美伐他汀提取工艺研究

研究从发酵液中提取美伐他汀的工艺条件。通过单因素实验确定了从美伐他汀发酵液中提取美伐他汀的最佳工艺条件。结果表明,醋酸丁酯作为提取溶剂时,其最佳工艺条件如下:提取温度为50℃,物料比(醋酸丁酯体积(mL):菌丝质量(g))为8:1,提取时间为3 h,闭环温度为70℃,闭环时间为6 h。本工艺简便,收率高,适用于工业化生产。

美伐他汀对人多发性骨髓瘤细胞系U2 66体外增殖与凋亡的影响

为了探讨羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG CoA)还原酶抑制剂对多发性骨髓瘤 (MM)细胞增殖与凋亡的调控作用及机制 ,应用MTT比色法、光镜形态学观察、流式细胞术、DNA凝胶电泳及RT PCR研究了美伐他汀(mevastatin )对MM细胞系U2 6 6细胞体外增殖与凋亡的影响。结果显示 ,美伐他汀以剂量及时间依赖方式抑制U2 6 6细胞增殖 ;细胞周期分析显示美伐他汀诱导U2 6 6细胞G0 -G1 期阻滞 ,但对 p2 7蛋白及mRNA的表达无影响 ;在美伐他汀作用下U2 6 6细胞出现核染色质凝聚、核固缩、核碎裂等凋亡形态改变 ,PI- AnnexinⅤ + 细胞增多 ,线粒体跨膜电位 (△ψm)下降 ,DNA凝胶电泳出现梯形条带 ,bcl 2mRNA表达下调。加入外源性甲羟戊酸 (meva lonate,MVA)可完全逆转美伐他汀对U2 6 6细胞增殖与凋亡的效应。结论 :美伐他汀可通过MVA途径 ,诱导G0-G1 期阻滞抑制增殖、下调bcl 2表达及降低线粒体膜电位触发U2 6 6细胞凋亡。

RP-HPLC法测定发酵液中美伐他汀及其转化产物普伐他汀的含量

采用反相高效液相色谱法测定发酵液中美伐他汀和普伐他汀含量。色谱柱为Ｎｏｖａ－ＰａｋＣ１８，流动相为甲醇－水－乙酸－三乙胺（体积比７５２５１１），检测波长为２３６ｎｍ。方法简便、快速。相关物质的回收率为９８．４８％～１０１．９０％，ＲＳＤ为０．８９％～２．９％。

在线颗粒度分析仪在美伐他汀结晶工艺过程中的应用研究

在线颗粒度分析仪(FBRM)是专门为在线监测颗粒度相关参数设计的一种仪器,本文采用FBRM对美伐他汀药物结晶工艺进行在线监测。在现行生产工艺的基础上,从复合溶剂、养晶时间和溶解程度3个方面对美伐他汀工艺进行考察,得出以下结论:(1)在现行工艺的控制范围内,复合溶剂优化在美伐他汀粗品∶甲苯∶乙酸乙酯=1∶3∶0.5时,颗粒度总数最多,平均粒径较小,最适宜工业化生产;(2)养晶时间选择在25min左右为宜;(3)降温结晶前无需经过超滤等前处理,溶解40min左右后即可降温结晶,对产品质量和产量影响不大。

P21蛋白和XIAP在美伐他汀诱导A549细胞凋亡中的作用

目的研究P21蛋白和凋亡相关基因XIAP在美伐他汀诱导A549细胞凋亡中的作用及其分子机制。方法应用MTT法检测细胞系的增殖作用,流式细胞仪、透射电镜检测细胞周期和凋亡;用流式细胞术、Western blot和RT-PCR检测P21蛋白、XIAP蛋白及P21和XIAP mRNA的表达。结果美伐他汀呈剂量和时间依赖性对A549增殖产生抑制;并诱导A549细胞G0/G1期阻滞和凋亡。美伐他汀对P21 mRNA及P21总蛋白的表达无影响,但可使P21胞膜蛋白的表达下降。美伐他汀作用后XIAP mRNA及XIAP蛋白的表达均下降。加入甲羟戊酸可完全逆转美伐他汀的上述作用。结论美伐他汀通过甲羟戊酸途径抑制A549细胞增殖并诱导凋亡,使细胞周期进程阻滞于G0/G1期,XIAP参与美伐他汀诱导A549细胞凋亡的基因调控。美伐他汀靶向HMG-CoA还原酶,抑制P21蛋白异戊二烯化、阻止P21蛋白与细胞膜的结合,不影响P21总蛋白的表达。

P21蛋白和生存素在美伐他汀诱导人非小细胞肺癌凋亡中的作用

目的研究P21蛋白和生存素(survivin)在美伐他汀诱导非小细胞肺癌(NSCLC)细胞凋亡中的作用及其分子机制。方法应用MTT法检测美伐他汀对A549、NCI-H520细胞株的抑制作用,应用流式细胞仪、透射电镜研究美伐他汀对A549、NCI-H520细胞株的细胞周期阻滞和诱导凋亡作用,应用流式细胞仪和RT-PCR检测P21蛋白、P21mRNA、生存素mRNA的表达。结果MTT试验表明美伐他汀对A549、NCI-H520增殖有明显的抑制作用;流式细胞仪检测显示美伐他汀诱导A549、NCI-H520细胞G0/G1期阻滞;AnnexinV结果证实美伐他汀可诱导A549、NCI-H520细胞凋亡,而且凋亡率随剂量的增加而增加。美伐他汀对A549、NCI-H520细胞P21mRNA及P21总蛋白的表达无影响,但可使P21胞膜蛋白的表达下降。美伐他汀作用后生存素mRNA表达下降。加入甲羟戊酸可完全逆转美伐他汀的上述作用。结论美伐他汀通过甲羟戊酸途径诱导NSCLCG0/G1期阻滞,抑制增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与抑制P21蛋白异戊二烯化和下调生存素mRNA表达有关。

美伐他汀抑制甲状腺相关眼病眼眶前脂肪细胞的分化

目的:观察美伐他汀对体外培养的甲状腺相关眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)来源眼眶前脂肪细胞分化及过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome-proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ)mRNA表达的影响。方法:眼眶组织取自TAO行开眶减压术的患者。将TAO病眼眶前脂肪细胞分为A组(对照组)与B组(干预组),其中B组又分为B1～B5组,均采用鸡尾酒法诱导10 d,使其分化为脂肪细胞。A组采用常规诱导剂,B1～B3组在分化全程中分别加入5μmol/L(B1组)、10μmol/L(B2组)、20μmol/L(B3组)的美伐他汀,B4～B5组在分化第4天(B4组)与第8天(B5组)分别加入10μmol/L的美伐他汀直至分化结束。分化后的细胞以油红O染色后,于酶联免疫检测仪492 nm波长处测吸光度值,以测定分化后脂肪细胞相对含量。反转录聚合酶链反应法(reverse transcription polymerasechain reaction,RT-PCR)检测各组在分化结束时PPAR-γmRNA的表达水平。结果:分化后的A,B1,B2,B3组细胞吸光度值及PPAR-γmRNA表达均依次下降,组间两两比较差异均具有统计学意义(P<0.05);对A,B2,B4,B5组分化后细胞的吸光度值、PPAR-γmRNA表达分别进行两两比较,除A与B5组间的吸光度值、PPAR-γmRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)外,A,B4,B2组的吸光度值及PPAR-γmRNA表达均依次下降,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:美伐他汀抑制体外培养的TAO眼眶前脂肪细胞的分化与PPAR-γmRNA的表达,抑制程度呈浓度依赖性,并与前脂肪细胞分化的阶段有关,越在分化的早期,抑制作用越强。

顶空气相色谱法测定美伐他汀中有机溶剂残留量

目的建立美伐他汀中有机残留溶剂的测定方法。方法顶空气相色谱法。色谱条件:采用HB-5(30.0 m×0.32 mm×0.25μm)硅胶键合毛细管柱;柱温:初始温度为40℃,保持5 min后,升至90℃,升温速率为2℃/min,保持0 min,升至160℃,升温速率为30℃/min,保持2 min;检测器:火焰离子化检测器;进样器温度:220℃;检测器温度:260℃;载气:氮气;流速:4 ml/min;分流比:1∶10。结果丙酮在15.8～79.0μg/ml、乙酸乙酯在18.0～90μg/ml、甲苯在8.7～43.3μg/ml范围内峰面积与浓度呈较好线性关系。平均回收率(n=9)分别为丙酮101.0%,相对标准偏差值(RSD)=1.6%;乙酸乙酯99.8%,RSD=1.0%。结论本方法操作简便、结果准确,是控制美伐他汀中残留溶剂的可靠方法。

美伐他汀产生菌的原生质体诱变育种

以美伐他汀产生菌SIPI-8915为出发菌,研究了影响原生质体形成和再生的各种因素并选出最佳条件,其再生频率达到23.5%;并对原生质体进行紫外诱变育种,筛选到变异株。该菌株摇瓶发酵效价比对照提高30%,传代稳定好。

桔青霉产美伐他汀发酵条件优化和小罐放大

首先研究了不同碳、氮源,无机盐,初始pH值和接种量等因素对桔青霉HD-32-2产美伐他汀生产能力的影响,然后着重对4种发酵培养基组分(葡萄糖,麦牙糖,黄豆饼粉和磷酸氢二钾)进行正交试验,形成了最优的发酵培养基。与最初的发酵培养基相比,在最优发酵培养基上发酵水平提高了3倍,达到了986 mg/L,并在15 L小型发酵罐上进行了放大比较研究,进一步说明了优化后培养基具有明显的提高美伐他汀发酵水平的能力。

美伐他汀降低β-淀粉样蛋白神经毒性的体外研究

目的通过美伐他汀降低β-淀粉样蛋白(Aβ)神经毒性,从机制角度探讨他汀类药物辅助治疗阿尔茨海默病的可能性。方法在实验室培养神经细胞,并加入美伐他汀,观察美伐他汀是否具有活化AMPK的能力,并观察在给予美伐他汀的同时,Aβ导致的过磷酸化现象是否得到抑制。结果在样品中加入美伐他汀时,人神经上皮瘤细胞(SK-N-MC)神经细胞数降低情况改善。Western blot检测结果发现,美伐他汀作用24 h后,SK-N-MC神经细胞AMPK磷酸化。结论美伐他汀可能通过提高AMPK活性,对抗Aβ导致的神经毒性,并进一步抑制蛋白质过磷酸化,发挥保护神经的作用。

低能离子注入诱变美伐他汀高产菌株的选育

以提高美伐他汀的产量为目的,利用100 keV氮离子分4个剂量并辅之以制霉菌素抗性平板筛选美伐他汀高产菌株。结果表明:注入剂量为1×1014 N+/cm2时在10μg/mL制霉菌素抗性平板上的菌株的正变率最高,达到36.7%。筛选到了高抗性突变株CP-116,该菌株的发酵单位比出发菌株高35%,且遗传性能稳定。实验表明离子注入技术对选育美伐他汀高产菌株方面行之有效。

Microtetraspora sp转化美伐他汀至普伐他汀发酵条件的研究

小四孢菌(Microtetrasporasp)在不同的转化培养基和培养条件下,转化美伐他汀(Mevastatin)为普伐他汀(Pravastatin)。在转化培养基A,初始底物浓度为500mg/L时,摇瓶发酵7d,转化率为50.14%,Pravastatin产量达260mg/L;在3L发酵罐中间歇补加底物和1～4g/L葡萄糖,培养11d,Pravastatin产量达375mg/L,转化率为45.2%。

美伐他汀生物合成基因簇的研究进展

关伐他汀作为第1个被发现的他汀类药物^[1]，在该类药物的研究开发上占有极其重要的地位。对美伐他汀产生菌的研究可以有效地提高美伐他汀的产量。随着生物技术的发展，采用分子育种技术进行菌株改良，与传统育种方法相比，不仅可提高美伐他汀的产量，更有利于通过对药物合成功能基因的研究，实现由高通量向高内涵筛选的过渡。

微生物转化美伐他汀为普伐他汀的研究

从转化培养基、接种量、底物添加时间、底物初始浓度和底物添加方式5个方面研究了菌株Streptomycessp.108转化美伐他汀(底物)的能力,并在2.5L发酵罐上探索了最适的底物运行浓度。结果表明,适量增加底物浓度,尤其是间歇性添加底物,能够提高普伐他汀产量;当底物运行浓度在450mg/L左右时,转化率可达55%,普伐他汀终浓度可达1088mg/L。

溶剂重晶法降低美伐他汀杂质D的选择性研究

通过乙醇、丙酮、乙酸丁酯3种不同溶剂进行实验对比,筛选出丙酮为降低美伐他汀杂质D选择性较好的溶媒。

美伐他汀二次精制母液回收的研究

对美伐他汀(Mevastatin)二次精制母液进行回收工艺的研究,确定了美伐他汀二次精制母液进行浓缩结晶,所得湿粉再用20倍体积的甲苯溶解后,加入0.2倍体积2%NaHCO3溶液洗涤,甲苯相再浓缩结晶的回收工艺,以HPLC检测方法测定回收品含量为70%,美伐他汀母液平均回收率为60%。该工艺具有简单可靠,收率较高、成本较低的特点。