海南五指山美洲商陆抗病毒蛋白PAP-Ⅰ基因的原核表达及活性验证

提取春季海南五指山美洲商陆叶片总RNA,利用RT-PCR技术获得c DNA,再根据Genbank上公布的PAP-Ⅰ基因序列设计引物扩增PAP-Ⅰ基因,并连接到p^(ET)-30a载体上进行表达,表达的产物以不溶的包涵体形式存在,经过变性、镍柱亲和层析纯化,纯化后的重组蛋白经过Western Blot验证表明该基因得到了正确表达,利用柱上循环复性后的重组PAP-Ⅰ蛋白经麦胚提取物转录/翻译偶联系统验证具有抑制蛋白质合成的活性。

美洲商陆抗病毒蛋白及其在艾滋病治疗中的应用

美洲商陆抗病毒蛋白是一种天然的广谱抗病毒试剂 ,其抗 HIV活性 ,已引起国内外学者的广泛兴趣和重视。旨在综述美洲商陆抗病毒蛋白的结构、核糖体失活活性、抗病毒活性及其在艾滋病治疗中的应用 。

美洲商陆抗病毒蛋白基因遗传转化甘蔗的研究

构建叶片特异表达启动子rbcs驱动的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAP-c的植物表达载体PNRPL,冻融法转化农杆菌EHA105后,通过农杆菌介导法侵染甘蔗优良品种ROC22的胚性愈伤组织,经PPT抗性筛选以及PCR鉴定,共获得了24株转化植株,对其中的5株进行Southern杂交检测,有2株呈阳性,初步证明外源基因已整合到甘蔗基因组中;对其接种甘蔗花叶病毒,初步结果表明获得的转化植株对甘蔗花叶病毒具有一定的抗性。

毕赤酵母Mut^+和Mut^s重组子表达美洲商陆抗病毒蛋白基因的比较

将N末端信号肽和C末端毒性区域缺失突变的美洲商陆抗病毒蛋白 (pokeweedantiviralprotein ,PAP)基因表达载体pPIC9K P酶切线性化后 ,通过电击转化整合到巴氏毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115菌株细胞中 ,PCR筛选出表型为利用甲醇快速型(Mut+ )的重组子。在相同培养条件下比较Mut+ 重组子和利用甲醇缓慢型 (Muts)重组子在表达缺失突变型PAP方面的异同。结果表明 ,诱导培养 4 8h后 ,Mut+ 重组子表达产物在SDS PAGE胶上可见清晰目的带 ,而Muts 重组子培养 72h才能见到微弱的目的带。抗病毒活性实验表明Mut+ 重组子和Muts 重组子的表达产物均对TMV病毒侵染有明显的抑制作用 。

美洲商陆抗病毒蛋白的研究

美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral proteins.PAP)是一种具有多种生物功能活性的蛋白质,其在广谱抗病毒方面有重要的应用价值。综述美洲商陆抗病毒蛋白的分子结构与功能,抗病毒的分子机理及其在植物基因工程中的应用。

美洲商陆抗病毒蛋白对人神经胶质瘤细胞U251细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)对人神经胶质瘤细胞U251细胞增殖和凋亡的影响。方法:采用MTT法检测0、20、40、60、80和100mg/LPAP处理48h以及40mg/LPAP处理24、36、48和72h对神经胶质瘤细胞U251细胞生长的影响;40mg/LPAP处理U251细胞36h后,采用荧光染色技术检测细胞凋亡,采用流式细胞仪检测U251细胞周期分布的影响;采用Northernblot和Westernblot检测40mg/LPAP处理24、48、72和96h对U251细胞周期调控蛋白FasL和Fas的影响。结果:0、20、40、60、80和100mg/LPAP处理48h,U251细胞的增殖抑制率间的差异有统计学意义(F=284.560,P=0.007),40mg/LPAP处理24、36、48和72h,U251细胞的增殖抑制率间的差异有统计学意义(F=280.250,P=0.045)。PAP促进U251细胞凋亡(t=106.350,P=0.007),PAP改变细胞周期分布,使G0+G1期细胞比例增高,S期比例降低。PAP还可上调FasL蛋白表达,下调Fas蛋白表达。结论:PAP可改变细胞周期分布,影响细胞周期调控蛋白表达,并可诱导U251细胞凋亡,从而抑制细胞增殖。

美洲商陆抗病毒蛋白研究进展

美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweedantiviralproteins,PAP)是一类具多种生物功能和活性的蛋白,本文在阐述了该类蛋白的生化等特性的同时,综述了该类蛋白在抗植物病毒、抗动物病毒以及用作免疫毒素等方面的研究进展。

美洲商陆抗病毒蛋白在毕赤酵母中的表达及其诱发人神经胶质瘤细胞U251凋亡的研究

目的研究美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein,PAP)基因的克隆表达,进而研究其诱发人神经胶质瘤细胞U251凋亡。方法利用RT-PCR技术克隆PAP基因,构建PAP毕赤酵母表达质粒pPICZaA-PAP并导入毕赤酵母Pichia pastorisGS115。SDS-PAGE检测PAP的分泌表达。采用镍离子亲合层析纯化PAP,并通过单细胞凝胶电泳和MTT检测其抑制人神经胶质瘤细胞U251的生长。结果分泌表达的PAP融合蛋白分子量约为35/kD,纯化的PAP在体外能诱发人神经胶质瘤细胞U251凋亡,PAP对U251半数抑制浓度(IC50)为81.0μg/mL,通过单细胞凝胶电泳,能看到明显的慧星尾,表明PAP引起了神经胶质瘤细胞基因组的降解。结论 PAP蛋白能抑制神经胶质瘤细胞的生长及诱发人神经胶质瘤细胞U251凋亡。

美洲商陆抗病毒蛋白cDNA转化烟草的研究

构建两个美洲商陆抗病毒蛋白(Pokeweed antiviral protein,PAP)基因的植物表达载体pBIPAP和pBIPAPv,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,经PCR检测证实获得了转基因植株,接种实验显示转基因烟草对TMV具有一定的抗性。

农杆菌介导的矮牵牛遗传转化美洲商陆抗病毒蛋白基因的研究

为获取矮牵牛抗病毒株系,利用农杆菌介导的叶盘法,对3个品种的矮牵牛进行了PAP(美洲商陆抗病毒蛋白)基因遗传转化试验。结果表明,矮牵牛基因型对抗性芽的再生有显著影响,只有红色波浪系矮牵牛在含100 mg/L的卡那霉素筛选培养基上获得抗性芽,进一步转入含卡那霉素100 mg/L的生根培养基上进行筛选,获得31个株系的生根植株。对再生植株进行PCR检测,初步证明PAP基因已整合到其中29个株系的矮牵牛基因组中。

美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ基因的克隆和表达

根据报道的cDNA序列,用RT-PCR的方法从美洲商陆夏季的叶片中克隆美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ(pokeweedantiviralproteinⅡ,PAP-Ⅱ)基因。将PAP-Ⅱ基因克隆至表达载体pET-28a(+)并在大肠杆菌中表达,SDS-PAGE电泳分析结果表明,PAP-Ⅱ蛋白在BL21(DE3)菌中获得表达,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体、复性和BBSTNTA树脂柱亲和层析纯化,获得高纯度的PAP-Ⅱ蛋白。用非放射性基于ELISA方法检测经过复性纯化后PAP-Ⅱ蛋白和蓖麻毒素A链(RTA)在体外对HIV-1整合酶有较强的抑制活性,其IC50分别约为303μg/mL,220μg/mL。用MTT法分析PAP-Ⅱ蛋白的生物学活性,复性纯化后蛋白对HEP-G2和Hela细胞有细胞毒作用,IC50分别为93μg/mL,102μg/mL,说明了PAP-Ⅱ蛋白能抑制肿瘤细胞的生长。构建的PAP-Ⅱ表达系统所表达的蛋白经复性后具有生物学活性,为进一步研究PAP-Ⅱ的抗HIV-1机制和抗肿瘤作用奠定了基础。

商陆抗病毒蛋白基因的克隆、序列分析及在原核中的表达

从美洲商陆 (Phytolaccaamericana)叶片中通过异硫氰酸胍法提取出了完整的总RNA ,经RT PCR扩增出缺失突变型PAP基因 ,将该基因与克隆载体pGEM(r) T相连接 ,从SP6和T7两端同时对其进行序列测定 ,共测得 711个碱基 ,与国外报道的PAP基因序列相比较 ,其同源性达 99.6 %。同时将该基因克隆至原核表达载体pET 5a上 ,转化大肠杆菌菌株BL2 1(DE3) plysS ,在 0 .4mmol/LIPTG的诱导下表达 ,经SDS PAGE分析表明 ,该基因在大肠杆菌中得到了特异性表达 ,表达蛋白大小为 2 6ku ,与预期值相符。Westernblotting分析发现该表达蛋白与法国PAP抗血清有特异反应。琼脂双扩散免疫沉淀法鉴定发现表达蛋白与其自己的抗血清及法国的PAP抗血清均能形成免疫沉淀线 ,且这两条沉淀线在相交处呈融合状态 ,说明原核表达的该蛋白与法国从商陆叶片中提取出的PAP具有高度的同源性 。

美洲商陆核基因组抗病毒蛋白基因的克隆及序列分析

通过ＰＣＲ扩增，从美洲商陆（Ｐｈｙｔｏｌａｃａａｍｅｒｉｃａｎａ）核基因组中克隆了商陆抗病毒蛋白基因，序列分析表明，该基因含８８５个核苷酸，与已报道的序列比较，核苷酸同源性为９９．３％。

美洲商陆细胞株系的选择和蛋白质产生情况比较

美洲商陆抗病毒蛋白（ＰＡＰ）是由多基因转译的，在不同细胞株系中这些基因的表达情况有所区别，在商陆愈伤组织培养中分离获得数株色泽有区别的株系，分析其过氧化物同工酶酶谱表明，这些株系在遗传上有区别。同时，这些株系在生长速度，总蛋白质含量、蛋白质组成及部分区域的蛋白质比例上存在较大的差别，其中白色株系具有较明显的优点，对其培养条件进行优化又使总蛋白质含量提高７０％，从而用于进一步的研究。

光对商陆发状根生长和PAP基因表达的影响

利用发根农杆菌菌株Ar1334与美洲商陆（Phytolacca americana）叶片外植体共培养转化体系,共获得58个发状根无性系（SL-1-58）.以发根农杆菌Ri质粒TL-DNA上的rol C基因设计特异引物,对发状根进行PCR检测,得到了预期的560 bp目的片段,表明Ri质粒T-DNA整合到发状根基因组中.将筛选出的株系SL-7接种在MS培养基上分别置于光、暗条件下进行培养.结果发现：SL-7在暗培养条件下呈乳白色,具有多分枝、多根毛、无向地性等典型的发状根特性;在光培养条件下,发根呈粉红色,少分支且生长缓慢;以商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral protein,PAP）cDNA片段为探针,分别对光、暗条件下的发状根进行Northern blot检测,发现光对PAP基因的转录具有一定抑制作用;将发状根粗蛋白提取液与TMV病毒液混合后,摩擦接种于心叶烟（Nicotiana glutinosa）离体叶片,发现暗培养的发状根粗蛋白提取液对TMV抗性明显提高.表明商陆发状根的生长及PAP基因的表达都受到光的负向调控.该结果为商陆发状根的规模化培养和PAP蛋白的离体合成优化体系的建立奠定了基础.

美洲商陆抗病毒蛋白及其在植物病害防治中的应用

美洲商陆抗病毒蛋白具有多种生物功能,在植物病害防治中有广阔的发展前景。本文较系统综述了该蛋白的种类、理化性质、抗病毒机制及其在植物病害防治上的应用等方面的研究进展。

pap和ipt共表达与提高转基因烟草抗病性的初步研究

通过构建pap与ipt共表达的双元载体,利用农杆菌介导,将pap与ipt共表达基因导入烟草K326品种的叶肉细胞,经过抗性筛选和鉴定,获得高表达的转基因植株,并对其进行了攻毒实验.结果表明:pap与ipt共表达基因转化烟草的转化率明显提高(25%),证实转基因细胞中ipt基因表达可降低PAP细胞毒性;接种烟草花叶病毒(TMV)后,pap高表达的转基因植株出现病症的时间延迟20 d,叶片失绿程度较轻,表明该转基因植株对病毒的抗性有一定程度的提高.

商陆愈伤组织的筛选及其对TMV抗性的研究

商陆抗病毒蛋白(PAP)是一种广谱的植物抗病毒蛋白.本试验以商陆叶片为外植体,在附加0.5 mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和0.5 mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)的MS培养基上诱导愈伤组织,通过继代筛选培养获得3个稳定的愈伤组织株系:黄色系(Y-型)、粉色系(P-型)、红色系(R-型),不同株系具有不同的生长特性.Northern杂交结果证明不同株系中PAP基因转录水平有明显差异.离体烟草叶片摩擦接种实验表明,不同株系的蛋白提取液对TMV均具有显著抗性,其中黄色株系具有较明显的优势.商陆离体愈伤组织的研究为生产安全、高效的植物源抗病毒制剂提供了一定基础.

商陆抗病毒蛋白抗病毒作用研究进展

美洲商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral protein，PAP）是从美洲商陆属植物Phytolacca acinosa的不同生长阶段或不同组织中分离和纯化出来的一类具有酶功能的核糖体单链失活蛋白（ribosome-inactivating proteins，RIP）。由于PAP具有特异的细胞毒特性，对细胞蛋白质合成的抑制作用以及广谱的抗病毒生物活性，而受到广大研究者的日益关注，本文就PAP抗病毒作用的有关研究综述如下。