美洲大蠊多肽和顺铂联用对HepG2细胞凋亡及自噬的影响

采用MTT法检测美洲大蠊多肽(PAP-3)与不同浓度的顺铂(DDP)单用或联合使用对人肝癌HepG2细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测PAP-3、DDP单独或联合给药干预对HepG2细胞凋亡的影响;Western Blot检测PAP-3、DDP单独或联合给药后HepG2细胞内自噬相关蛋白p62、LC3、Beclin-1、Atg5及PI3K的表达。实验结果显示,与DDP单独给药相比,PAP-3与DDP联合给药对HepG2的细胞的抑制作用更强;PAP-3与DDP联合给药组中细胞的凋亡率与DDP和PAP-3单独给药组相比均有升高(P<0.05)。与对照组相比,DDP组中,p62蛋白水平降低,LC3II蛋白水平升高,LC3II/I的比例也升高,表现出细胞自噬流的活化;与DDP组相比,联合给药组中p62蛋白水平回升,LC3II蛋白水平和LC3II/I的比例均有回落。且联合给药组中PI3K、Atg5、Beclin-1等自噬相关蛋白的量均较DDP组减少,而凋亡相关的Caspase-3蛋白的表达量则较DDP组增加。据此推测,PAP-3和DDP的联用可以通过抑制HepG2细胞自噬相关蛋白的表达水平,抑制DDP带来的细胞自噬水平的升高,增加细胞对DDP的敏感性,从而诱导HepG2细胞凋亡。

美洲大蠊多肽PAP-2对肝癌血管生成、侵袭及转移能力的影响

目的:通过体内实验探讨美洲大蠊多肽PAP-2对肝癌血管生成、侵袭及转移能力的影响和作用机制。方法:建立Balb/c小鼠荷瘤模型,观察美洲大蠊多肽PAP-2、CⅡ-3和脱脂膏对肿瘤生长能力的影响;苏木精-伊红(HE)染色法观察肿瘤组织的病理变化;分别用酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组织化学染色(IHC)法检测小鼠血清中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、CD34分子、金属基质蛋白酶-9(MMP-9)和转化生长因子-β(TGF-β)的含量,肿瘤组织中的相应蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time qPCR)测定肿瘤组织中bFGF、MMP-9、TGF-β的mRNA表达水平。结果:PAP-2处理后肿瘤的生长受到抑制,脏器指数增加,肿瘤HE染色显示在不同剂量组均出现不同程度坏死;PAP-2可下调小鼠血清中的bFGF含量;PAP-2下调肿瘤组织中bFGF、CD34、MMP-9和TGF-β蛋白的表达作用优于CⅡ-3和脱脂膏(P<0.05),不同剂量的PAP-2对肿瘤组织中M MP-9 mRNA、bFGF mRNA、TGF-βmRNA的表达有一定的促进作用。结论:PAP-2可以抑制H22荷瘤小鼠的肿瘤生长,其作用机制与下调肝癌组织中bFGF、CD34、MMP-9和TGF-β蛋白的表达有关,PAP-2的作用优于CⅡ-3和脱脂膏。

美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用研究

目的:探讨美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用。方法:通过小鼠腋窝皮下注射H22肝癌小鼠腹水构建荷瘤小鼠模型。将70只小鼠随机分为模型组(生理盐水)、5-氟尿嘧啶组(阳性药对照,20 mg/kg)以及美洲大蠊提取物的脱脂膏组(200 mg/kg,以提取物量计)、CⅡ-3组(从浸膏中提取的以多肽为主要活性成分的组分,200 mg/kg,以提取物量计)和多肽PAP-2高、中、低剂量组(从CⅡ-3中分离得到,200、100、50 mg/kg,以单体量计),每组10只。5-氟尿嘧啶组小鼠隔天腹腔注射给药1次,其余各组小鼠均每天灌胃给药1次,给药周期均为10 d。给药结束后,观察小鼠瘤块变化并测定其脏器(脾、胸腺、肝)指数,苏木精-伊红染色后观察其瘤组织病理变化,并采用酶联免疫吸附试验法测定其血清中血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-4的含量。结果:脱脂膏、CⅡ-3和不同剂量的PAP-2均能不同程度地抑制荷瘤小鼠瘤块的生长并升高其脏器指数,且PAP-2的作用具有一定的量效关系。其中,PAP-2高剂量组的抑瘤率(38.95%)显著高于脱脂膏组和CⅡ-3组(P<0.05),并与5-氟尿嘧啶组(40.87%)接近(P>0.05);PAP-2高剂量组小鼠脾指数、胸腺指数、肝指数较模型组均显著升高(P<0.05),并显著高于CⅡ-3组(P<0.05),且其肝指数显著高于脱脂膏组(P<0.05)。此外,PAP-2还可降低荷瘤小鼠血清中VEGF和IL-4含量、升高其血清中IL-1β含量,其中PAP-2高剂量组与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05);并且PAP-2高剂量组小鼠血清中IL-1β含量显著高于脱脂膏组和CⅡ-3组(P<0.05),IL-4含量显著低于脱脂膏组和CⅡ-3组(P<0.05),但是其血清中VEGF含量显著低于脱脂膏组和CⅡ-3组(P<0.05)。结论:美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用,可升高其脏器指数,降低其血清中VEGF、IL-4含量并升高其血清中IL-1β含量。

美洲大蠊多肽PAE_(2)逆转耐药细胞株多药耐药性的研究

目的:探讨美洲大蠊多肽PAE2逆转人肝细胞癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU多药耐药性的作用及机制。方法:以人肝细胞癌敏感细胞株BEL-7402和人肝细胞癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU为研究对象。采用噻唑蓝比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测细胞活力;荧光定量聚合酶链式反应(real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫细胞化学染色法检测细胞中谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase-π,GST-π)、DNA拓扑异构酶Ⅱ(topo-isomerase typeⅡ,TopoⅡ)和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的mRNA和蛋白的相对表达量。结果:美洲大蠊多肽PAE2能有效逆转人肝细胞癌耐药细胞BEL-7402/5-FU的多药耐药性,能下调多药耐药相关酶PKC、GST-π、TopoⅡ的mRNA和蛋白表达水平。结论:PAE2在体外逆转多药耐药的作用机制可能与下调多药耐药相关酶有关。

美洲大蠊多肽PAE_(2)基于AMPK调控自噬逆转BEL-7402/5-FU多药耐药的体外研究

目的:探究美洲大蠊多肽PAE_(2)基于腺苷-磷酸活化蛋白激酶(AMPK)调节自噬对人肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU多药耐药性的影响。方法:以人肝癌细胞株BEL-7402及人肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU为研究对象,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定AICAR的作用时间及浓度;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞中AMPK含量;实时聚合酶链式反应(real-time PCR)检测细胞中AMPK mRNA的表达水平;real-time PCR检测细胞中自噬相关蛋白5(ATG5)、自噬相关蛋白7(ATG7)、磷酸肌醇-3-激酶3(PIK3C3)、Beclin 1、微管相关蛋白1亲链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、P62、Zeste同源物增强子2(EZH2)等mRNA的表达水平;激光共聚焦显微镜观察细胞中LC3-Ⅱ的表达;免疫细胞化学法(ICC)检测细胞中P62蛋白的表达。结果:美洲大蠊多肽PAE_(2)能够降低AMPK含量(P<0.05),也能降低AMPK mRNA的表达水平,显著降低自噬相关因子ATG5 mRNA、ATG7 mRNA、PIK3C3mRNA、Beclin 1 mRNA、LC3-ⅡmRNA的表达水平(P<0.05),明显提高P62 mRNA及EZH2 mRNA的表达水平(P<0.05),增加P62蛋白的表达(P<0.05)。结论:美洲大蠊多肽PAE_(2)能够通过下调AMPK的表达进而抑制自噬来逆转BEL-7402/5-FU细胞的多药耐药性。

美洲大蠊多肽PAP-2对Balb/c小鼠肝癌原位移植瘤免疫微环境的影响

目的探讨美洲大蠊多肽PAP-2对肝癌免疫微环境的影响,及其作用机制。方法通过给昆明种小鼠注入H22细胞悬液构建Balb/c小鼠肝癌原位移植瘤模型,将原位移植瘤小鼠随机分为10组:模型组,5-氟尿嘧啶组(20 mg·kg^(-1)5-FU),美洲大蠊多肽PAP-2低、中、高剂量组(50、100、200 mg·kg^(-1)PAP-2),5-氟尿嘧啶(20 mg·kg^(-1)5-FU)+PAP-2低、中、高剂量组(50、100、200 mg·kg^(-1)PAP-2),美洲大蠊CⅡ-3组(200 mg·kg^(-1)CⅡ-3),脱脂膏组(200 mg·kg^(-1)脱脂膏),5-Fu组隔天给药1次,其余各药物组每天1次,腹腔注射。通过检测抑瘤率、胸腺指数及脾指数,检测肿瘤组织中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和IL-1β的表达水平,检测小鼠脾细胞中相关淋巴细胞的变化水平。结果模型组、5-氟尿嘧啶组、美洲大蠊多肽PAP-2高剂量组、5-FU+PAP-2高剂量组、美洲大蠊CⅡ-3组、脱脂膏组的瘤质量分别为(0.96±0.15)、(0.33±0.19)、(0.30±0.23)、(0.12±0.04)、(0.35±0.12)和(0.41±0.06)g,IL-1β含量分别为(18.93±2.68)、(28.88±1.14)、(23.20±2.79)、(24.47±1.79)、(21.65±3.09)和(21.25±2.78)pg·mL^(-1),TNF-α含量分别为(12.32±1.12)、(25.71±0.98)、(14.25±1.94)、(23.06±1.71)、(13.49±1.38)和(14.34±2.18)pg·mL^(-1),巨噬细胞比例分别为(0.94±0.64)%、(3.19±1.12)%、(3.13±1.15)%、(5.45±3.49)%、(2.03±0.59)%和(3.76±0.44)%,B细胞比例分别为(35.53±9.84)%、(61.30±2.57)%、(59.63±3.36)%、(47.20±12.61)%、(53.60±5.68)%和(54.88±4.48)%。模型组的上述指标与其余各组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论美洲大蠊多肽PAP-2能够提高肝癌原位移植瘤小鼠的免疫功能,一定程度上改善其免疫微环境。

美洲大蠊多肽PAP-2对Balb/c裸鼠肝癌原位移植瘤缺氧微环境的影响

目的探讨美洲大蠊多肽PAP-2对肝癌缺氧微环境的影响,及其作用机制。方法BALb/c裸鼠用腋下接种HepG2肝癌细胞的方法构建肝癌原位移植瘤模型。将造模成功的裸小鼠随机分为模型组、阳性对照组(20 mg·kg^(-1)5-氟尿嘧啶)、CⅡ-3组(200 mg·kg^(-1)美洲大蠊提取物CⅡ-3)、脱脂膏组(200 mg·kg^(-1)美洲大蠊脱脂膏)和低、中、高剂量PAP-2组(50、100和200 mg·kg^(-1)美洲大蠊多肽PAP-2)及低、中、高剂量联合组(20 mg·kg^(-1)5-氟尿嘧啶+50、100和200 mg·kg^(-1)美洲大蠊多肽PAP-2),每组10只。各组小鼠均按0.1 mL·10 g^(-1)的剂量腹腔注射给药,除模型组和阳性对照组隔天1次外,其余各组每天1次,共计10 d。检测裸鼠移植瘤的抑瘤率和脏器指数,用实时荧光定量聚合酶链反应法检测肿瘤组织中缺氧诱导因子(HIF-1α)及血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达水平。结果高剂量PAP-2组、高剂量联合组、CⅡ-3组、脱脂膏组和阳性对照组的抑瘤率分别为62.19%、78.07%、52.14%、51.11%和53.73%。高剂量PAP-2组、高剂量联合组、CⅡ-3组、脱脂膏组、阳性对照组和模型组的脾指数分别为(129.98±3.97)、(139.98±14.18)、(66.48±6.93)、(64.90±5.31)、(108.61±11.32)和(45.47±6.42)mg·g^(-1),肝指数分别为(843.10±59.41)、(1112.62±37.28)、(720.68±77.70)、(709.77±51.80)、(927.66±69.19)和(497.21±59.81)mg·g^(-1),HIF-1αmRNA表达量分别0.96±0.09、0.55±0.22、0.97±0.29、0.86±0.22、0.88±0.32和1.28±0.22,VEGF mRNA表达量分别为0.75±0.29、0.23±0.07、0.84±0.18、0.90±0.21、0.69±0.21和1.12±0.12。高剂量联合组、高剂量PAP-2组、CⅡ-3组、脱脂膏组和阳性对照组的上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论美洲大蠊多肽PAP-2通过抑制相关血管生成因子的表达水平,抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞迁移,改善肝癌缺氧微环境。

美洲大蠊多肽对人肝癌细胞Bel-7402裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的:探讨美洲大蠊多肽对裸鼠人肝细胞Bel-7402移植瘤生长及血管生成的抑制作用。方法:建立裸鼠人肝癌细胞株Bel-7402移植瘤模型,观察美洲大蠊多肽对肿瘤生长、微血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。结果:美洲大蠊多肽不同程度抑制裸鼠移植瘤的生长,各治疗组给药后肿瘤体积、相对肿瘤体积和相对肿瘤增殖率明显下降,与对照组比较,P<0.05;美洲大蠊多肽治疗组微血管分布较稀疏,MVD值由对照组的(64.77±13.49)分别降低到(41.52±5.36),(35.56±5.12)和(30.28±4.17),差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。美洲大蠊多肽治疗组能明显减少VEGF的阳性表达,阳性表达率由对照组的(75.35±13.89)%减少到(59.77±12.07)%,(42.19±11.57)%和(35.88±10.26)%,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:美洲大蠊多肽能明显抑制Bel-7402裸鼠移植瘤的生长,降低肿瘤MVD,减少瘤组织中VEGF的表达,揭示其抗肿瘤作用与抑制血管生成有关。

美洲大蠊多肽逆转人肝癌HepG2/ADM细胞多药耐药性的作用及机制研究

目的探讨美洲大蠊多肽(PAE_(2))逆转人肝癌多药耐药细胞株HepG2/ADM的作用及机制。方法噻唑蓝(MTT)法检测HepG2/ADM细胞对不同化疗药物的耐药性以及PAE_(2)联合化疗药物(5-氟尿嘧啶、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、奥沙利铂)对HepG2/ADM细胞增殖的影响;激光共聚焦观察PAE_(2)对HepG2/ADM细胞中药物累积的影响;Western blotting法检测PAE_(2)对HepG2/ADM细胞凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X,Bax)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase 9,Caspase-9)、DNA修复酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)表达的影响;qRT-PCR法检测PAE_(2)对多药耐药蛋白1(multiple drug resistance 1,MDR1)、乳腺癌耐药相关蛋白(breast cancer resistant protein,BCRP)和酶介导的多药耐药途径中蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、拓扑异构酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ,TopⅡ)的m RNA表达。结果PAE_(2)抑制Hep G2/ADM细胞增殖,呈时间和剂量相关性。PAE_(2)可逆转Hep G2/ADM对不同化疗药物的耐药性;PAE_(2)可上调Hep G2/ADM细胞中阿霉素水平,呈剂量相关性。PAE_(2)可显著上调耐药细胞中Bax、cleaved Caspase-9 p37蛋白表达水平(P<0.05、0.01),显著下调Bcl-2蛋白表达水平(P<0.01),对cleaved PARP蛋白表达无显著影响。PAE_(2)均显著下调Hep G2/ADM细胞中MDR1、BCRP、PKC、TopⅡm RNA水平(P<0.01)。结论PAE_(2)可以通过减少药物外排、促进细胞凋亡、下调耐药蛋白表达等途径逆转Hep G2/ADM细胞的多药耐药性。

美洲大蠊多肽PAE2逆转肝癌多药耐药性

目的:探讨美洲大蠊多肽PAE2体内逆转肝癌多药耐药(MDR)的作用及机制。方法:采用Balb/c-nude小鼠腋下接种HepG2和HepG2/ADM细胞分别建立肝癌敏感株动物模型和肝癌MDR动物模型,模型制备成功后,将裸鼠随机分为正常组,HepG2模型组,HepG2/ADM模型组,索拉菲尼组[30 mg·kg^(-1),灌胃(ig)],HepG2/ADM+PAE2[静脉注射(iv)]低、中、高剂量组(50,100,200 mg·kg^(-1)),HepG2/ADM+PAE2ig低、中、高剂量组(50,100,200 mg·kg^(-1)),脱脂膏组(200 mg·kg^(-1),ig),美洲大蠊前期粗提物CⅡ-3组(200 mg·kg^(-1),ig),每2日测量1次裸鼠体质量及肿瘤体积,并记录,末次给药后,次日取裸鼠肿瘤组织,记录瘤质量,采用免疫组织化学(IHC)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)测定美洲大蠊多肽PAE2对肿瘤组织中P糖蛋白(P-gp),肺耐药相关蛋白(LRP),乳腺癌耐药蛋白(BCRP),蛋白激酶C(PKC),谷胱甘肽巯基转移酶-π(GST-π),拓扑异构酶Ⅱ(ToPoⅡ),MDR基因1(MDR1)及MDR相关蛋白1(MRP1)蛋白水平和基因水平表达的影响。另同时设置口服和静脉2种给药组别以研究美洲大蠊PAE2的基本药代动力学特征。结果:裸小鼠体质量方面,造模成功后,与正常组比较,裸小鼠体质量明显减轻(P<0.05),经各药物治疗后,体质量有一定回升,但仍然不及正常裸小鼠。抑瘤作用方面,与模型组比较,美洲大蠊多肽PAE2iv组中剂量组抑瘤效果最好(P<0.05),口服给药组抑瘤作用随剂量的增加而增加,高剂量组效果最好(P<0.05),美洲大蠊前期粗提物CⅡ-3无明显抑瘤作用,脱脂膏具有一定的抑瘤效果(P<0.05)。MDR相关蛋白和酶方面,美洲大蠊多肽PAE2在体内对MDR相关的蛋白和酶均有一定影响,主要可能通过抑制肿瘤组织内LRP,BCRP表达和不同程度影响上述相关蛋白、基因表达而抑制细胞内药物外排,从而促进肿瘤凋亡,且作用优于美洲大蠊前期粗提物CⅡ-3和脱脂膏。结论:美洲大蠊多肽PAE2可能通过影响介导MDR的相关蛋白和酶的表达,减少药物外排,促进细胞内药物累积、细胞凋亡,从而发挥逆转HepG2/ADM细胞Balb/c-nude小鼠移植瘤MDR的作用。

美洲大蠊多肽PAE2逆转BEL-7402/5-FU细胞多药耐药性的作用及机制研究

本研究探讨了美洲大蠊多肽PAE2逆转人肝细胞肿瘤耐药细胞株BEL-7402/5-FU的多药耐药性作用及机制。以人肝细胞肿瘤敏感细胞株BEL-7402、人肝细胞肿瘤耐5-氟尿嘧啶(5-FU)细胞株BEL-7402/5-FU和Balb/c-nude小鼠为研究对象,采用噻唑蓝比色分析法检测BEL-7402/5-FU细胞的多药耐药性和交叉耐药性,通过激光共聚焦显微镜观察阿霉素在BEL-7402/5-FU细胞中的累积。使用实时荧光定量聚合酶链式反应和免疫细胞化学染色法检测BEL-7402/5-FU细胞中P-糖蛋白1(P-glycoprotein 1,P-gp1)、多药耐药相关蛋白1(multi-drug resistance protein 1,MRP1)、肺耐药相关蛋白1(lung resistance protein 1,LRP1)以及乳腺癌耐药蛋白1(breast cancer resistance protein 1,BCRP1)的mRNA和蛋白的相对表达量,确定美洲大蠊多肽PAE2逆转多药耐药性的机制。此外,在Balb/c-nude小鼠中,建立BEL-7402/5-FU细胞的腋下移植瘤模型,观察美洲大蠊多肽PAE2对腋下移植瘤小鼠的免疫器官、肝肾功能、肿瘤抑制与诱导肿瘤细胞调亡、调节肿瘤组织多药耐药相关蛋白等环节的影响。结果显示,美洲大蠊多肽PAE2能有效逆转BEL-7402/5-FU细胞的多药耐药性和交叉耐药性,作用机制可能与下调多药耐药相关蛋白的表达水平有关,降低了多药耐药细胞对抗肿瘤药物的外排能力、影响抗肿瘤药物分子代谢,从而达到逆转人肝细胞癌多药耐药的作用。

美洲大蠊多肽对血管生成的影响

目的:探讨美洲大蠊多肽对血管生成的作用,探讨其机制。方法:以人脐静脉内皮细胞HUVECs和人肝癌Hep G2细胞为研究对象,采用噻唑蓝(MTT)比色法和细胞划痕实验,观察不同质量浓度(6. 25,12. 5,25,50,100 mg·L-1)的美洲大蠊多肽(PAP-1～3),脱脂膏和美洲大蠊多肽前体物CⅡ-3对HUVECs增殖、迁移的影响,另设正常组和沙利度胺组;采用小管形成实验检测各组HUVECs小管形成能力;通过细胞间黏附实验,观察不同质量浓度(25,50,100 mg·L-1)的美洲大蠊提取物处理后人肝癌Hep G2细胞同HUVECs之间黏附能力;利用免疫细胞化学染色和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测各组HUVECs中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达。结果:MTT比色法结果显示,多肽均能抑制HUVECs的增殖(P <0. 05),呈剂量依赖关系。不同质量浓度多肽分别作用24,48,72 h,PAP-2的抑制作用优于PAP-1,PAP-3(P <0. 05)。不同质量浓度的CⅡ-3和脱脂膏作用,HUVECs的存活率明显升高。细胞划痕实验结果显示多肽均能抑制HUVECs迁移(P <0. 05),且随药物浓度的增加,抑制迁移的作用也越强。其中PAP-2的作用优于PAP-1和PAP-3(P <0. 05); CⅡ-3在一定程度上能抑制HUVECs迁移,但是剂量越大,抑制作用越弱;脱脂膏作用后,HUVECs迁移能力增强。小管生成实验结果显示,多肽均能抑制HUVECs小管形成(P <0. 05),且随着给药浓度的增大,抑制作用越强。其中,PAP-2对小管形成的抑制作用优于PAP-1和PAP-3(P <0. 05)。CⅡ-3和脱脂膏一定程度上促进HUVECs小管的形成。细胞间黏附实验结果显示,多肽均能阻断Hep G2同HUVECs之间的黏附(P <0. 05),其中PAP-2对Hep G2同HUVECs间黏附的阻断作用强于PAP-1和PAP-3(P <0. 05)。相反,CⅡ-3和脱脂膏在一定程度上却能促进Hep G2同HUVECs间黏附。免疫细胞化学染色和ELISA实验结果显示,多肽均能够下调HUVECs细胞中VEGF含量(P <0. 05),且呈浓度依赖性。其中,PAP-2对VEGF的下调作用优于PAP-1和PAP-3(P <0. 05)。而CⅡ-3和脱脂膏能上调HUVECs中VEGF的表达。结论:美洲大蠊多肽对HUVECs的侵袭和转移,分化形成小管的能力有一定抑制作用,并能下调细胞中VEGF蛋白的表达。其中,美洲大蠊多肽的作用优于CⅡ-3和脱脂膏,多肽中PAP-2的作用较优。

美洲大蠊多肽PAE_(2)对人肝癌BEL-7402和BEL-7402/5-FU裸鼠皮下移植瘤侵袭转移的影响

目的 基于腺苷酸活化蛋白激酶靶点在动物水平上探讨美洲大蠊多肽PAE;逆转肝癌多药耐药细胞BEL-7402/5-FU的机制研究。方法 以Balb/c-nude裸鼠为实验对象,建立裸鼠皮下人肝癌BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞瘤模型(敏感肝癌细胞模型和耐药肝癌细胞模型)。将裸鼠分为正常组、敏感组(敏感肝癌细胞模型)、耐药组(耐药肝癌细胞模型),索拉菲尼组(耐药肝癌细胞模型,给予30 mg·kg^(-1)阳性药索拉菲尼)和高、中、低剂量实验组(耐药肝癌细胞模型,分别给予200,100,50 mg·kg^(-1)多肽PAE_(2))。计算裸鼠抑瘤率及脏器指数;以生化分析仪检测裸鼠生化指标;以苏木精-伊红(HE)染色法观察肿瘤组织及肝组织的病理学变化;以实时定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测肿瘤组织中侵袭转移相关因子mRNA表达水平。结果 敏感组、耐药组、索拉菲尼组和高、中、低3个剂量实验组MMP2表达水平分别为0.01±0.00,1.00±0.00,0.02±0.01,0.01±0.01,0.07±0.02和0.00±0.00;这6组的MMP9表达水平分别为0.01±0.02,1.00±0.00,0.18±0.08,0.01±0.00,0.04±0.01和0.00±0.00;这6组的4EBP1表达水平分别为0.23±0.08,1.00±0.00,1.80±0.30,0.20±0.06,0.66±0.16和0.12±0.06。PAE;组与耐药组相比,各项mRNA表达水平均明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论 美洲大蠊多肽PAE_(2)可通过腺苷酸活化蛋白激酶靶点影响裸鼠肿瘤细胞的侵袭转移因子,降低肿瘤组织中MMP2等mRNA的侵袭,从而抑制裸鼠肿瘤的生长。

美洲大蠊多肽PAE2对HepG2/ADM移植瘤裸鼠凋亡蛋白表达及血管生成的影响

目的 探究美洲大蠊多肽PAE_(2)对HepG2/ADM移植瘤裸鼠凋亡蛋白表达及血管生成的影响。方法 将HepG2或HepG2/ADM细胞株接种于裸鼠皮下构建裸鼠肝癌皮下移植瘤模型。接种HepG2细胞的8只模型鼠为敏感组;接种HepG2/ADM细胞的模型鼠随机分为耐药组、阳性对照组和低、中、高剂量实验组,每组8只;另取8只正常裸鼠作为正常组。阳性对照组灌胃给予30 mg·kg^(-1)索拉非尼;低、中、高剂量实验组分别灌胃给予50,100和200 mg·kg^(-1)多肽PAE_(2);正常组、敏感组和耐药组均灌胃给予等量0.9%NaCl。7组裸鼠每天给药1次,连续给药14 d。测定肝指数及脾指数,用蛋白质印迹法检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平,用免疫组化法检测血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达水平。结果 敏感组、耐药组、阳性对照组及低、高剂量实验组的肝指数分别为(73.37±0.08),(54.78±12.62),(49.88±6.54),(44.54±4.83)和(53.39±2.55)mg·g^(-1),脾指数分别为(10.87±1.08),(7.72±2.53),(5.43±0.99),(5.72±1.07)和(6.37±1.32)mg·g^(-1),Bax相对表达量分别为0.65±0.06,0.62±0.04,0.68±0.01,0.85±0.14和0.81±0.12,Bcl-2相对表达量分别为0.80±0.22,0.96±0.32,0.37±0.16,0.54±0.15和0.14±0.05,VEGF表达量分别为0.05±0.01,0.07±0.01,0.06±0.01,0.07±0.01和0.05±0.01。与耐药组相比,低剂量实验组的肝指数、脾指数、Bcl-2和VEGF表达量均显著降低,Bax表达量显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 多肽PAE_(2)可通过促进移植瘤细胞凋亡及抑制肿瘤血管生成来逆转肝癌的多药耐药。

美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的制备及细胞毒性研究

目的:研究美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的制备及体外细胞毒性。方法:通过低温诱导相分离法制备美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒,应用光学显微镜和扫描电镜观察其形态,通过实时无标记细胞分析仪和流式细胞术检测美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒体外细胞毒性,评估其生物安全性。结果:制备的美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒圆整均一,平均粒径约为5μm,载药量为86.70%,包封率为66.70%,美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒浓度为0.00、0.05、0.10、0.20、0.40 mg/mL时,对HepG2细胞作用24 h时,细胞存活率分别为97.76%、86.44%、87.20%、83.48%、83.23%,可见一定浓度范围内载药微粒对HepG2细胞无明显细胞毒性。结论:该研究制备的美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒无明显细胞毒性,可进一步应用于干粉吸入剂或缓释微球等剂型的研究。

美洲大蠊提取物对人肝癌HepG_2细胞的作用机制研究

目的探讨美洲大蠊提取物体外对肝癌(HCC)HepG_2细胞增殖、迁移能力,以及细胞中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响。方法噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;划痕实验检测美洲大蠊提取物对HCC细胞迁移能力的影响;免疫细胞染色法、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测美洲大蠊提取物对细胞中VEGF蛋白表达的影响。结果 MTT和划痕实验结果表明,美洲大蠊多肽、CⅡ-3和脱脂膏能抑制人HCC HepG_2细胞的增殖和迁移,且呈时间、剂量依赖关系;免疫细胞化学染色法和ELISA法结果显示,美洲大蠊多肽、CⅡ-3及脱脂膏能下调人HCC HepG_2细胞中VEGF蛋白的表达。结论美洲大蠊多肽、CⅡ-3及脱脂膏能抑制人HCC HepG_2细胞增殖和迁移,同时能降低HepG_2细胞中VEGF蛋白的表达,且美洲大蠊多肽的作用优于CⅡ-3和脱脂膏。