羟基丁酸与羟基辛酸共聚体骨组织工程支架的初步研究

采用粒子滤出／冷冻干燥复合法制备羟基丁酸与羟基辛酸共聚体[P（HB-HO）]多孔支架，并进行扫描电镜观察、孔隙率和力学性能检测以及体外降解和细胞相容性实验。结果表明，P（HB-HO）多孔支架孔隙分布均匀，连通性好，孔隙率为50％～90％时，抗压强度在1．7～6．2MPa之间，十二周体外降解率约为20％；与P（HB-HO）复合培养的小鼠成骨样细胞MC3T3-E1黏附率高，生长状态良好。证明P（HB-HO）具有良好的理化性能和细胞相容性，有望成为一种具有临床应用价值的骨组织工程支架材料。

新型支架材料羟基丁酸与羟基辛酸共聚体的生物相容性

文章选用细胞毒性实验、急性全身毒性实验、溶血实验、热源实验、皮内刺激实验、遗传毒性实验和皮下植入实验等7个生物相容性实验对生物可降解支架材料羟基丁酸与羟基辛酸共聚体的生物相容性进行评价。结果发现羟基丁酸与羟基辛酸共聚体及其浸提液与小鼠成骨细胞共培养时,细胞生长形态均良好,数量逐渐增加,无细胞毒性;羟基丁酸与羟基辛酸共聚体浸提液无急性毒性反应;其溶血率为1.67%,符合ISO规定的溶血率<5%的标准;将其注入家兔耳缘静脉后未引起发热反应;注入家兔皮内未引起皮肤刺激反应;注入小鼠尾静脉未引起遗传毒性反应;将羟基丁酸与羟基辛酸共聚体膜植入皮下12周,尚未发现明显的炎症反应。提示羟基丁酸与羟基辛酸共聚体具有良好的生物相容性。

7-羟乙基白杨素聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒的制备及体外释放评价

目的:制备和评价7-羟乙基白杨素(7-HEC)聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒。方法:采用乳化溶剂挥发法制备7-HEC/PLGA纳米粒,以粒径、多分散系数(PDI)、包封率、载药量及Zeta电位为评价指标,通过单因素考察结合Box-Behnken响应面法优化处方。采用甘露醇作为冻干保护剂制备冻干粉,对最优处方制备的7-HEC/PLGA纳米粒进行表征及体外释放研究。结果:经Box-Behnken响应面法优化后的最优处方为:药载比2.12∶20,油水体积比1∶14.7,乳化剂为2.72%大豆磷脂。最优处方条件制备的7-HEC/PLGA纳米粒的平均粒径为(240.28±0.96)nm、PDI为0.25±0.69、包封率为(75.74±0.80)%、载药量为(6.98±0.83)%、电位为(-18.17±0.17)mV。体外释放48 h内累积释放度达到50%以上。结论:优化所得处方工艺稳定、操作简便。所得7-HEC/PLGA纳米粒粒度均匀,包封率较高。相对于7-HEC原料药,7-HEC/PLGA纳米粒的溶出度显著提高。

羟基丁酸-羟基辛酸共聚体/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附性

背景:羟基丁酸-羟基辛酸共聚体[poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyoctanoate),PHBHOx]是一种新型的多聚羟基烷酸类材料,具有优良的可塑性、生物相容性、生物可降解性等性能,但同其他酯类材料相似,PHBHOx亲水性能较差,单纯PHBHOx材料支架细胞黏附性能明显不足。目的:观察羟基丁酸-羟基辛酸共聚体/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附性。方法:取新鲜猪膝关节表面透明软骨,采用非离子型去污剂TritonX-100、低渗Tris-HCl以及Dna酶和Rna酶等进行脱细胞处理。低温粉碎后与PHBHOx以不同比例复合,采用溶剂浇铸-颗粒沥滤技术制备支架。分离培养猪关节软骨细胞,进行细胞-支架黏附实验并通过MTT比色法和扫描电镜观察软骨细胞在支架上的黏附存活情况。结果与结论:PHBHOx/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附率较对照组显著提高,软骨细胞在支架上黏附紧密,生长良好。提示复合脱细胞软骨基质可以明显提高单纯PHBHOx支架的细胞黏附性能。

羟基丁酸-羟基辛酸共聚物/脱细胞软骨基质复合支架的制备与体外降解

背景:羟基丁酸-羟基辛酸共聚物具有高生物相容性和降解性,但单一材料无法满足组织工程支架的要求。脱细胞软骨基质是制备复合支架的常用材料,具有良好的生物相容性和无抗原性等优点。目的:将羟基丁酸-羟基辛酸共聚物、脱细胞软骨基质以不同比例混合制备复合支架,观察其体外降解速率。方法:取新鲜猪关节软骨,用含有双抗的PBS液浸泡,放入含有苯甲基磺酰氟的tri-HCl缓冲液,加入DNase酶和RNase酶,用D-Hank’s液冲洗等步骤制备脱细胞软骨基质。采用溶剂浇注-颗粒沥滤的方法与羟基丁酸-羟基辛酸共聚物按不同浓度混合,制备出不同比例的复合支架。结果与结论:脱细胞软骨基质的比例不同,复合材料的完全降解时间也不同,8%含量的脱细胞软骨基质最符合软骨组织工程支架的要求。

羟基丁酸与羟基辛酸共聚物一体化骨软骨组织工程支架的制备及性能

背景：单层支架难以满足关节软骨损伤修复的要求,现提出骨软骨共同修复的一体化支架,以弥补了单一支架的部分缺陷。目的：以羟基丁酸与羟基辛酸共聚物为基础材料,羟基磷灰石等为复合材料研制一体化骨软骨组织工程支架,测试该支架的物理特性和细胞黏附性。方法：采用溶剂浇铸/颗粒沥滤法,以支架孔径、孔隙率、力学强度和细胞黏附生长率为检测指标,以羟基丁酸与羟基辛酸共聚物为连续相,通过改变致孔剂NaCl粒径和羟基磷灰石材料配比制备不同形态结构、力学强度和生物学功能的三层一体化骨软骨组织工程支架。结果与结论：致孔剂与支架材料的最佳质量配比分别为软骨层4.5/1,过渡层2.5/1,硬骨层3.5/1。扫描电镜观察显示支架的三层结构明显不同且紧密结合,其软骨层、过渡层、硬骨层的孔径分别为150~250μm,≤60μm,150~450μm;孔隙率检测结果依次为84%,60%,75%;力学强度测定依次为2.93,6.43,4.30MPa;支架对骨髓间充质干细胞无毒性,细胞黏附与生长状态良好。结果表明该一体化骨软骨组织工程支架具有仿生学特性,符合骨软骨组织工程支架的基本条件。

羟基丁酸-羟基辛酸共聚体/胶原骨软骨一体化支架修复膝关节软骨损伤

背景:由于骨软骨组织自身复杂的生理学特性,关节软骨损伤的临床修复效果难以令人满意,组织工程学方法和手段修复膝关节软骨缺损成为一种新的治疗模式,为临床修复骨软骨缺损提供了新的思路。目的:观察羟基丁酸-羟基辛酸共聚体/胶原蛋白仿生一体化支架对兔膝关节软骨损伤的修复情况。方法:以羟基丁酸与羟基辛酸为基础材料,混合一定比例胶原蛋白,采用溶剂浇铸/颗粒沥滤法,制备骨软骨一体化支架,接种分离、培养的种子细胞。选取4周龄健康新西兰大白兔24只,复合麻醉后,股骨髁关节面部位用电动骨钻造成关节软骨缺损(直径4.5 mm,深度5 mm),处理后随机分为3组,空白组损伤处直接缝合;对照组损伤处植入单纯支架;实验组损伤处植入支架-软骨细胞复合体。分别于术后8,20周取出股骨髁后,通过大体及组织学观察缺损处修复情况。结果与结论:(1)8周:实验组缺损处见透明薄膜组织覆盖,细胞小、不规则;对照组缺损较明显,纤维组织为主;空白组缺损无明显修复痕迹;(2)20周:实验组软骨缺损处以透明软骨样组织覆盖,细胞排列规则;对照组缺损处白色膜状组织覆盖,基底部分及边缘可见较多软骨细胞存在;空白组缺损可见少量新生组织;(3)结果表明:复合种子细胞的羟基丁酸-羟基辛酸共聚体/胶原骨软骨一体化支架有利于关节软骨缺损修复。

自养黄杆菌合成羟基丁酸和羟基戊酸共聚体的发酵研究

采用本实验室从土壤中分离到的一株自养黄杆菌进行了羟基丁酸和羟基戊酸共聚体〔P(HB-co-HV)〕的发酵试验。实验结果表明,该菌株是自养黄杆菌葡萄糖运输突变株,可以葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乙酸盐、乳酸盐和苹果酸盐作为唯一碳源,尤以葡萄糖和果糖效果最佳。硫酸铵、氯化铵和蛋白胨等不同氮源不影响其生长,却影响细胞中P(HB-co-HV)的含量和P(HB-co-HV)中HV/HB的比例。应用两阶段控制方式,经42h的补料分批发酵,细胞浓度达34.9g·L^(-1),P(HB-co-HV)浓度达25.28g·L^(-1)。细胞和P(HB-co-HV)生产速率系数分别为0.83g·L^(-1)”·h^(-1)和0.61g·L^(-1)·h^(-1)。以基质为基准的细胞得率系数(Yx/s)、产物得率系数(Yp/s)和以干细胞为基准的产物得率系数(Yp/x)分别为0.283(g/g)、0.174(g/g)和0.73(g/g)。改变培养基中碳氮源组分可将P(HB-co-HV)中HB的含量调节在24％～78％之间。

费氏中华根瘤菌合成羟基丁酸和羟基己酸共聚体的研究

进行了费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)合成羟基丁酸和羟基己酸共聚体[P(HB-HH)]的研究,通过摇瓶正交试验优化了培养基成分、培养条件和癸酸盐调控条件,采用发酵罐分批发酵和两阶段补料分批发酵方式及两步加盐法研究了P(HB-HH)的高密度发酵技术参数。经55h发酵,P(HB-HH)产量可以达到17.55g/L,其中HH单体含量占共聚体的20.6%,该共聚体的分子量约为1.4×105D。结果表明S.fredii的生产性状优良,有可能通过该菌株的高密度发酵与代谢调控实现P(HB-HH)的工业化生产。

鼠骨髓间充质干细胞诱导的成骨细胞与3-羟基丁酸/3-羟基己酸共聚物的体外相容性

目的探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导的成骨细胞与3-羟基丁酸/3-羟基己酸共聚物(PHBHHx)支架材料的体外相容性,进一步验证PHBHHx材料作为骨组织工程支架材料的可行性。方法将SD大鼠BMSCs诱导的成骨细胞与PHBHHx支架材料体外复合培养,通过扫描电镜观察细胞与材料的复合情况,用MTT法检测材料对细胞增殖的影响。结果成骨细胞在PHBHHx支架材料表面及孔隙中能较好地黏附和增殖。结论 PHBHHx与成骨细胞有良好的体外相容性,是一种性能优良的骨组织工程支架材料。

聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜与人骨髓间充质干细胞的体外生物相容性

背景:聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物是近年来受到重视的聚羟基脂肪酸族组织工程支架材料,具有免疫排斥反应低、生物相容性好和降解产物无毒副作用的优点。目的:观察聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜材料与人骨髓间充质干细胞的体外生物相容性。方法:将第3代人骨髓间充质干细胞种植于聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜上作为实验组,培养板单纯培养细胞作为对照组,计算1,2,4 h两组贴壁细胞的数量,得出细胞贴壁率。MTT比色法观察2,4,6,8 d两组细胞的增殖情况。采用Hoechst33258荧光法,检测3,6,9,12 d两组细胞内的DNA含量。将人骨髓间充质干细胞接种聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜材料上5 d后,电镜扫描观察细胞在材料上的生长情况。结果与结论:共培养1 h时,实验组的细胞贴壁率低于对照组;其他时间段两组之间细胞贴壁率差异无显著意义。两组各时点间的细胞增殖差异无显著意义。两组各时间点细胞内DNA含量差异无显著意义。扫描电镜观察人骨髓间充质干细胞在聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜上生长良好,形态呈梭形,细胞间连接紧密,分泌较多细胞基质。证明聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜材料与人骨髓间充质干细胞有良好的生物相容性。

磷酸钙骨水泥/印第安刺猬蛋白/聚乳酸羟基共聚物微球复合物制备及体外释放性能初步研究

目的:观察不同浓度印第安刺猬蛋白(Ihh)对小鼠骨髓来源单核巨噬细胞(BMDMs)增殖分化的影响,筛选最适浓度用于后续实验,并初步探索磷酸钙骨水泥/印第安刺猬蛋白/聚乳酸羟基共聚物(CPC/Ihh/PLGA)微球复合物的制备工艺及体外释放情况。方法:选择6~8周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠10只,处死后分离骨髓,纯化BMDMs并进行培养。根据培养基不同分为空白对照组、100 ng/ml Ihh组、200 ng/ml Ihh组、300 ng/ml Ihh组、400 ng/ml Ihh组和500 ng/ml Ihh组。利用CCK-8法检测不同浓度Ihh对小鼠BMDMs增殖速率的影响。采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法评估不同浓度Ihh促小鼠BMDMs破骨向分化能力。采用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同浓度Ihh对小鼠BMDMs破骨向分化相关基因mRNA表达的影响。应用复乳溶剂挥发法制备Ihh/PLGA微球。利用扫描电子显微镜观察微球形态并计算其粒径大小。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测微球中Ihh包封率。最后制备CPC/Ihh/PLGA微球复合物并对其体外释放特性进行研究。结果:与空白对照组比较,不同浓度Ihh组在细胞接种后第1、3、5天时对小鼠BMDMs均有促进增殖的作用(均P<0.05),但不同浓度组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。随着Ihh浓度的升高,破骨细胞生成数目、破骨向分化相关基因[抗酒石酸酸性磷酸酶5(Acp5)、组织蛋白酶K(Ctsk)和核因子κB受体活化因子(RANK)]mRNA表达表现为先升高再降低的趋势,且300 ng/ml Ihh组破骨细胞生成数目及破骨向分化相关基因mRNA相对表达量高于其他浓度组(均P<0.05)。制备负载最适Ihh浓度的PLGA微球后,该微球粒径为(54.02±8.63)μm,微球中Ihh包封率为65.41%。制备CPC/Ihh/PLGA微球复合物后,其体外累积释放量为78.04%。结论:Ihh能够促进小鼠BMDMs增殖及破骨向分化,最适浓度为300 ng/ml,将其负载于PLGA后成功制备CPC/Ihh/PLGA微球复合物,且该复合物在体外具有缓释作用。

利用静电技术制备羟基丁酸-羟基-辛酸共聚物纤维毡及微球

目的:利用静电技术制备缓释药物微球及纤维毡,并研究其缓释效果。方法:以总丹参酮为模型药物,羟基丁酸-羟基辛酸共聚物为载体,制备缓释微球、纤维毡。结果:微球、纤维毡331 h后累积释放率分别是37.2%、46.3%。结论:利用静电技术制备药物微球及纤维毡是开发药物新剂型中有效的途经,具有发展前景。

聚(3-羟基丁酸和4-羟基丁酸酯)共聚物与聚乳酸共混体系性能研究

研究了可完全生物降解的聚(3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸酯)与聚乳酸(PLA)共混体系,利用偏光显微镜、动态和静态剪切流变、X 射线衍射和差示扫描量热仪,分析共混体系的结晶性能、流变性能和热稳定性。结果表明:随着 PLA 添加量增加,熔融温度由156.05℃降低到130.32℃,结晶温度由102.09℃降低62.33℃,结晶度下降。而玻璃化转变温度由-8.69℃上升3.42℃,体系的热稳定性和黏弹性提高。

聚羟基丁酸及其共聚物在体内组织相容性和降解率的实验研究

目的 评价作为组织工程心脏瓣膜支架材料的聚羟基丁酸/聚羟基戊酸共聚物(Poly-hydroxybutyrate/hydroxy-valerate,PHBV)、聚羟基丁酸(Polyhydroxybutyrate,PHB)两种生物可吸收材料的组织相容性和皮下吸收情况。方法 对照研究两种材料经皮下埋植后2、4、6、8和10周的大体观察及组织学检查。结果 PHBV皮下包埋8周仍保持膜状结构,10周完全降解,组织相容性及皮下吸收情况优PHB。结论 PHBV符合组织工程心脏瓣膜支架材料的基本要求。

生物合成羟基丁酸和羟基己酸共聚体的底物水平调控

对费氏中华根瘤菌SR-008菌株合成多聚羟基烷酸(PHAs)进行了底物水平的代谢调控研究。通过摇瓶试验对所添加底物癸酸盐的浓度、添加量以及加盐时间等进行了比较,并运用气相色谱测定了代谢产物PHAs的含量和单体的比例。结果表明,经癸酸盐调控后,该菌合成的PHAs产物为羟基丁酸和羟基己酸的共聚体P(HB-HH),调控时的加盐最适浓度为2.5mmolOD·L,加盐时间在细胞生长的对数期末期。

羟基丁酸-羟基辛酸一体化骨软骨支架的体外血管化

背景:前期实验构建的羟基丁酸-羟基辛酸共聚体一体化骨软骨支架具备良好的生物相容性、生物可降解性,并且降解产物无毒性。目的:将兔肾微血管内皮细胞与羟基丁酸-羟基辛酸一体化骨软骨支架复合培养,观察支架骨层血管化效果。方法:运用溶剂浇铸-颗粒沥滤法,制备具有骨层/骨与软骨界面层/软骨层3层结构的羟基丁酸-羟基辛酸一体化骨软骨支架。将传代培养至第3代的兔肾微血管内皮细胞,接种到一体化骨软骨支架骨层支架上,MTT法检测细胞在支架上的增殖活性,10 d后苏木精-伊红染色及电镜观察细胞在支架内的生长状况。结果与结论:一体化骨软骨支架外观具备明显的3层结构,各层之间连接紧密,骨层疏松多孔,各层支架孔隙均匀且相通,一体化支架孔隙率为78%。兔肾微血管内皮细胞在支架上分裂增殖良好,复合培养10 d后,细胞在骨层支架内呈立体生长,中间界面层内未发现细胞,苏木精-伊红染色可见细胞黏附生长于骨层支架孔隙间,细胞依附支架的多孔结构生长,形成管腔样结构,但细胞并未长入中间界面层。

聚羟基丁酸-羟基辛酸共聚酯载生长因子的缓释纳米微球

背景:骨形态发生蛋白2可增加软骨细胞和祖细胞基质的产生,可增强组织金属蛋白酶抑制因子1、sox9基因、Ⅱ型胶原以及聚集蛋白聚糖的表达,具有诱导间充质细胞迁徙、增殖、分化,最终促使软骨、骨形成的作用。目的:制备重组人骨形态发生蛋白2聚羟基丁酸-羟基辛酸共聚酯纳米微球系统纳米微球缓释系统,观察微球生长因子形态和粒径分布、载药量、包封率、体外缓释时间及生物活性。方法:采用复乳-干燥法制备重组人骨形成蛋白2聚羟基丁酸-羟基辛酸共聚酯纳米微球系统,体外分离培养猪软骨细胞。实验分为3组:第1组培养液不添加药物做为对照;第2组培养液中添加含20μg/L重组人骨形态发生蛋白2;第3组培养液中添加20μg/L重组人骨形态发生蛋白2聚羟基丁酸-羟基辛酸共聚酯纳米微球系统纳米微球;其中在第2组和第3组又将重组人骨形态发生蛋白2和重组人骨形态发生蛋白2聚羟基丁酸-羟基辛酸共聚酯纳米微球系统纳米微球分别设为55,100μg/L两种的有效浓度,采用MTT法检测微球对软骨细胞增殖的影响,模拟体内条件观察纳米微球的体外缓释性及生物活性。结果与结论:该纳米微球表面光滑圆整,球体大小均匀,粒径为231-415 nm,扫描电镜平均粒径323 nm。微球的包封率和载药量分别为(79.63±0.16)%和(1.92±0.16)%。根据15 d内对重组人骨形态发生蛋白2聚羟基丁酸-羟基辛酸共聚酯纳米微球的体外释药的观察,保持持续释放重组人骨形态发生蛋白2,且释放的浓度呈增长水平。该微球缓释系统有生物活性,能显著促进猪软骨细胞的增殖,其效应高于单纯重组人骨形态发生蛋白2的效应。提示重组人骨形态发生蛋白2聚羟基丁酸-羟基辛酸共聚酯纳米微球缓释系统包封率、载药量、体外释药性以及生物活性符合纳米微球的一般规律,能够满足相应的软骨缺损修复要求。

β-羟基丁酸-羟基戌酸共聚物(PHBV)纤维成形

对β-羟基丁酸-羟基戊酸共聚物(PHBV)的结晶性能、热降解性能、流变性能及可纺性进行了系统研究.结果表明:PHBV的球晶径向生长速率非常慢,但球晶尺寸很大;当加工温度超过170℃时,PHBV开始发生热降解;PHBV熔体流动曲线受温度和停留时间影响较大;在对现有熔融纺丝成形设备适当改造后,通过严格控制纺丝成形工艺条件,可纺制出力学性能满足美国药典要求的PHBV长丝.