叠氮溴化丙锭-羟基萘酚蓝-环介导等温扩增法检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌

将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)、羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)与环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术相结合,建立一种可视化PMA-HNB-LAMP方法快速检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)。结果表明,当PMA终质量浓度为5.0μg/mL、孵育和曝光时间均为15 min时,可有效抑制10~5 CFU/m L的单核细胞李斯特菌死菌DNA的聚合酶链式反应扩增,而对活菌DNA的扩增不具有抑制作用。LAMP反应体系中HNB终浓度为210μmol/L时,检测显色结果肉眼可见。该方法的纯菌液灵敏度为2.4×10~2 CFU/m L,人工污染肉制品的检出限为2.3×10~4 CFU/m L。分别采用国标法、PMA-HNB-LAMP法和HNB-LAMP法检测20份市售畜禽肉样,3种方法的单核细胞李斯特菌检出率分别为5%、10%和20%。PMA-HNB-LAMP法在一定程度上可解决LAMP法的假阳性问题,并且具有操作简单、可视性强的优点。

对羟基萘酚兰二钠盐敏化共振光散射法测定DNA的研究

在pH10.23的Tris-HCl缓冲溶液中,阴离子主体小分子对羟基萘酚兰二钠盐(HNB)对阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)与脱氧核糖核酸(DNA:fsDNA、ctDNA)的共振光散射光谱有协同增强作用.考察了共振光散射(RLS)光谱的影响因素,在优化条件下共振光散射强度增加值(ΔI)与DNA浓度之间呈良好的关系,据此建立了一种测定DNA的新方法,该方法具有反应速度快(只须1min)、稳定性好、灵敏度高等特点.对于fsDNA、ctDNA的线性范围分别为0.05～2.5 mg/L,0.04～2.0 mg/L,检出限分别为25.9 ng/mL,24.9 ng/mL.用于fsDNA合成样测定效果较好.

6-羟基山萘酚-3-O-β-葡萄糖苷抑制脱氧核糖氧化损伤的机理

目的:研究6-羟基山萘酚-3-O-β-葡萄糖苷(6-HK-3-O-G)抑制Fenton反应和对羟自由基清除的能力,并对其抑制Fenton反应的机理进行初步探讨。方法:利用脱氧核糖氧化损伤的实验检测模型和DPPH自由基的清除实验。结果:6-HK-3-O-G对羟自由基具有较强的清除能力;对Fenton反应引起的2-脱氧核糖氧化损伤具有保护作用,其保护作用机理与6-HK-3-O-G直接对Fenton反应所产生的羟自由基的清除作用有关,但更主要的可能是由于6-HK-3-O-G与Fe2+的络合作用,阻断了Fenton反应的进行。结论:6-HK-3-O-G具有强的抗氧化活性,在生理条件下,6-HK-3-O-G与Fe2+的络合作用可能是其抑制Fenton反应的关键因素。

催化过氧化氢氧化β,β-二羟基连二萘酚固体基质室温磷光猝灭法测定痕量钛

基于Triton X-100增敏钛催化过氧化氢氧化β,β-二羟基连二萘酚（R）反应，导致R的固体基质室温磷光信号猝灭效应，建立了高灵敏度固体基质室温磷光（SS—RTP）测定痕量Ti（IV）的新方法．Ti（IV）量在0．010-2．00fg斑^-1（对应浓度范围0．025～5．0pg·mL^-1，点样体积0．40μL）与磷光信号△Ip成线性关系，回归方程△Ip=11．52＋10．73CTi（IV）（pg·mL^-1）}，r=0．9993，检出限0．0045fg·斑^-1（对应浓度为1．1×10^-14g.mL^-1）．所建立方法成功用于茶叶、人发样品中痕量钛的测定，加标回收率分别为99．2％和103．3％，RSD分别为2．9％和3．8％．

小反刍兽疫LAMP反应结果可视化检测方法比较研究

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种可应用于各种病原体检测、基因分型等领域的等温扩增技术。该技术所需设备简单且易于操作,因此具有较大的发展潜力。根据目前已经存在的判定LAMP结果的可视化方法,以可能对野生小反刍动物造成威胁的小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)cDNA为检测对象,选择合适的引物组,比较评估均可在日光或紫外光下区分阴阳性结果的SYBR Green I、SYBR Safe Stain和羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue,HNB)3种指示剂方法的适用性与灵敏度。结果表明:3种方法的灵敏度都很高,均与琼脂糖凝胶电泳相当。其中,SYBR Green I结果区分度高、不受体系成分影响且无须额外设备,但成本较高;SYBR Safe Stain具有良好的结果区分度,成本相对较低,但需要额外的紫外照射设备;HNB成本最低,但颜色区分度较低,且易受多种因素影响。建议在选择LAMP指示剂时,综合考虑成本、使用便利性、结果准确性及实验条件,通过充分的体系优化和验证,确保LAMP检测的准确性和可靠性。研究结果突显了不同方法的特征和适用场景,为研究人员根据不同场所与条件选择高效、便捷的LAMP反应结果可视化方法提供参考。

多重氢键自组装联萘酚和含氮化合物(英文)

作为相互识别的结果,(±)-2,2'-二羟基-1,1'-联萘酚可与4,4',6,6'-四甲基-2,2'-联嘧啶、1,2-双(4-吡啶)乙烷、反式-1,2-双(4-吡啶)乙烯、4,4'-联吡啶-N,N'-双氧化物及双-2-吡啶基甲酮等多种含氮化合物分别形成外形良好的共晶化合物1,2,3,4及5.本文对5个共晶化合物的晶体结构进行了分析.结果表明,由于这些晶体结构中都存在强的O—H…O,N—H…O和O—H…N氢键,晶体可稳定存在.在这5个共晶中,各组分依靠强氢键形成无限一维极性排列.由于C—H…π和π…π等弱作用对晶体结构的形成产生很大作用并能影响到晶体骨架结构,因此,在这些弱作用的影响下,共晶1,2和5展现出二维层状结构,而共晶3和4呈现为三维超分子结构.

北美栅锈菌和松杨栅锈菌可视化检测体系建立

[目的]为实现北美栅锈菌和松杨栅锈菌快速有效的鉴别及鉴定。[方法]本研究根据两种锈菌的28SrDNA基因序列设计若干组LAMP引物。经筛选得到的引物以北美栅锈菌、松杨栅锈菌、图拉斯叉钩丝壳菌、芍药白粉菌、梨胶锈菌、羊肚菌、金针菇的基因组DNA为模板进行LAMP反应并完成特异性检测;首先建立初始LAMP反应体系,再进一步优化LAMP反应体系的组分和反应条件,加入羟基萘酚蓝实现可视化检测;最后确定检测体系灵敏度。[结果]表明,筛选出的引物具有特异性;25μL北美栅锈菌LAMP检测体系最佳Mg^(2+)浓度为6 mmol·L^(−1),最佳内外引物比例为8:1,最佳dNTPs浓度为1.2 mmol·L^(−1);同样地,25μL松杨栅锈菌LAMP检测体系最佳Mg^(2+)浓度为4 mmol·L^(−1),最佳内外引物比例为6:1,最佳dNTPs浓度为1 mmol·L^(−1)。加入160μM羟基萘酚蓝(HNB)可清晰地指示反应结果,两种检测体系在61℃条件下,分别反应30 min和40 min可实现目视判断结果,且灵敏度分别可达34 fg·μL^(−1)和60 fg·μL^(−1)。[结论]通过建立两种锈菌的可视化LAMP-HNB检测体系可实现对北美栅锈菌和松杨栅锈菌进行区分及鉴定,为快速鉴定和区分重要杨树锈病提供了技术支撑和实践参考。

基于环介导等温扩增技术检测橡树疫霉菌

应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了基于颜色判定的简单、快速和灵敏的橡树疫霉菌(Phytophthora ramorum)检测方法。以ITS为靶序列对橡树疫霉菌的分子检测存在无法区分近似种的问题,笔者在橡树疫霉菌的基因组研究中,发现了PrA3aPro类转座子序列。生物信息学分析表明,该序列非常适合作为大豆疫霉分子检测的靶标。利用LAMP技术,以PrA3aPro为靶序列,设计LAMP特异性引物,建立LAMP反应体系与条件,并进行灵敏度和特异性试验。结果表明:整个检测过程仅需1 h,即可通过肉眼直接目测试验结果。在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1 h,然后经3种方法验证扩增结果:1)浊度仪验证浊度变化;2)琼脂糖凝胶电泳验证;3)在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化判定。特异性试验中,在橡树疫霉菌株中能够产生浊度曲线,扩增到梯形条带,同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应,而在其他疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象。在灵敏度试验中,PrA3aPro-LAMP技术最低检测限为1 ng.μL-1。该方法的建立为橡树疫霉菌的检疫及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。

一种测定微量铝的新荧光光度法

本文提出了一种测定微量铝的新的荧光光度法。Al^(3+)与羟基萘酚兰(HNB)形成配合物的荧光强度与铝的含量在1×10^(-5)～1×10^(-8)mol/L范围内呈现良好的线性关系,检测限为3.5×10^(-9)mol/L,对4×10^(-8)mol/L铝的11次检测,其相对标准偏差为2.9％。考察了二十多种离子的干扰情况,并成功地应用于粮食及人发中铝含量的测定。

利用环介导等温扩增技术检测黑白轮枝菌

[目的]黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)能够危害苜蓿等多种作物,是我国重要的检疫性病原真菌。我们基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立基于颜色判定的简单、快速和灵敏的黑白轮枝菌检测方法。[方法]基于LAMP技术,通过比对分析黑白轮枝菌与其相似种不同靶标序列间的差异,选取Tub(β-tublin,编码β-微管蛋白)基因作为靶标基因,设计并筛选了4条特异性强、灵敏度高的LAMP引物和1条环引物,在此基础上建立了检测黑白轮枝菌的LAMP体系,并进行特异性、灵敏度试验及田间发病组织的检测。该方法在62℃等温条件下进行核酸扩增反应70 min,扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),反应后根据染料颜色变化判定扩增结果。[结果]特异性试验中,仅黑白轮枝菌菌株DNA扩增后呈天蓝色的阳性反应,而在其他真菌的供试菌株中均呈紫色的阴性反应。该方法的最低检测限为1 pg·μL^(-1)。Tub-LAMP技术能够检测出发病苜蓿植物组织中的目标菌,在采自新疆的7份疑似样本中检测到3份阳性。在土壤中人工添加孢子的试验中,Tub-LAMP技术能够从每0.25 g土壤含有10个孢子和每10 g苜蓿种子含有50个孢子中检测出该病菌。[结论]该方法的建立为黑白轮枝菌的检疫及其所致病害的诊断提供了新的技术。

可视化环介导等温扩增技术在肺炎支原体检测中的应用

目的建立可视化肺炎支原体环介导等温扩增(LAMP)检测体系,并对其敏感性和特异性进行验证,以期开发出适合各级医院和现场高通量检测的肺炎支原体试剂盒。方法克隆肺炎支原体P1基因质粒,并以此为模板建立LAMP体系,优化肺炎支原体LAMP体系的各组分和反应参数,添加反应指示剂羟基萘酚蓝,用已知浓度的肺炎支原体P1质粒检测体系敏感性;以相近种类支原体和细菌检测体系特异性。结果建立的可视化肺炎支原体LAMP体系能特异性检测肺炎支原体,检测限为2×102copies/m L。结论建立的可视化肺炎支原体LAMP检测体系可应用于人肺炎支原体检测,价格低廉,无需贵重仪器设备,操作简便,适合各级医院和现场高通量肺炎支原体检测。

肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速可视化检测

目的应用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术和羟基萘酚蓝(Hydroxynaphthol blue,HNB)指示剂建立肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7快速可视化检测方法。方法针对EHEC O157∶H7脂多糖编码基因rfbE保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入染料HNB作为LAMP扩增的指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据HNB的颜色变化进行结果判定,并评价检测方法的特异性和灵敏度。结果本方法最低检出限约为100拷贝/反应管,高于普通PCR;检测特异性高,仅EHEC O157∶H7反应管HNB颜色由紫罗兰变成天蓝色,而肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、宋内志贺菌、福氏志贺菌均不发生变色反应;体系的扩增效率高于普通PCR,40 min内出结果。结论建立的基于颜色判定的EHEC O157∶H7 LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于EHEC O157∶H7现场快速检测。

等温扩增技术快速检测棕榈疫霉

【目的】棕榈疫霉是农林业生产上的一种危害严重的病原菌,建立棕榈疫霉的快速分子检测技术对于预测疫病发生情况、及时采取有效的防治方法控制疫病的传播和流行、减少经济损失具有重要意义。【方法】采用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了以基因间隔区(intergenic spacer,IGS)为靶标的快速、简单、特异和灵敏的棕榈疫霉菌的检测方法。以IGS基因为靶序列,利用环介导等温核酸扩增技术,设计了多组LAMP引物,同时建立并优化了LAMP反应体系与条件,最终筛选出1组扩增反应结果较好的LAMP引物,采用该组引物进行特异性、灵敏度和实际应用的验证。在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化判定反应结果。【结果】整个检测过程在等温64℃条件下仅需80 min即可通过肉眼直接目测试验结果。在特异性试验中,通过HNB显色只有在棕榈疫霉菌株中能观察到天蓝色的阳性反应,而在其他疫霉、腐霉和真菌的供试菌株仍为紫色的阴性反应;在灵敏度试验中,PpIGS-LAMP技术检测灵敏度达到10fg.μL^(-1)目标菌纯DNA;在实际应用中,PpIGS-LAMP技术能够快速检测出采自田间的木薯根部土壤中目标菌和人工接种发病木薯组织样品的目标菌。【结论】本研究在国内外首次采用环介导等温扩增技术检测棕榈疫霉,建立了1种快速、高灵敏度、高特异性、可视化的棕榈疫霉的LAMP检测方法。建立的棕榈疫霉菌的LAMP检测方法在80 min内可完成待检样品的检测过程,显著缩短检测时间,降低基层部门的检测成本,为棕榈疫霉引起疫病的检疫和所致病害的快速诊断提供了新的检测技术。

5-Br-PADN光度法连续测定铸铁中铜和镍

研究了以溴代十六烷基吡啶和TritonX 100为增溶剂,以5 Br PADN为显色剂,在pH为9.7的氨 氯化铵介质下连续测定铜和镍的方法。铜、镍与5 Br PADN的配合物在547nm处均有较大的吸收,其表观摩尔吸光系数为εCu=3.94×104L·mol-1·cm-1,εNi=3.64×104L·mol-1·cm-1,配合物至少可稳定12h,铜、镍分别在0～10μg/10ml和0～8μg/10ml范围内服从比耳定律,方法用于铸铁中铜和镍的连续测定,结果满意。

环介导等温扩增技术快速检测HPV18方法的建立

目的应用环介导等温扩增技术(LAMP)对人乳头瘤病毒18(HPV18)进行基因检测,建立一种快速、可视的HPV18核酸检测方法。方法针对HPV18病毒特异性E6区设计LAMP检测引物,通过调整反应物浓度建立LAMP反应体系,用羟基萘酚蓝(HNB)染料对产物进行可视化判定。通过检测其他不同基因型别的病毒评估引物特异性,检测倍比稀释的临床标本确定其灵敏度,通过LAMP法检测临床标本验证其与PCR法的一致性。结果利用LAMP方法检测到HPV18病毒E6引物的特异性好,恒温65℃条件下反应60 min即可较好完成检测。LAMP特异性好,灵敏度高,灵敏度为2.5×10~3拷贝/ml。LAMP可视化结果判定与PCR凝胶电泳结果相当,二者有较好的一致性(P>0.05)。结论建立了HPV18病毒的LAMP快速、可视化检测方法,该法操作简便快捷,具有很好的开发应用前景。

PMA-LAMP法可视化检测乳中沙门氏菌

建立一种荧光染料叠氮溴化丙锭(PMA)与环介导等温扩增(LAMP)相结合的技术,同时利用羟基萘酚蓝(HNB)染料对婴儿配方奶粉中沙门氏菌活菌进行快速可视化检测。以沙门氏菌siiA基因为靶点,设计特异性引物,利用PMA抑制死菌DNA的扩增反应,反应前向体系中加入HNB染料,通过颜色变化对目标菌进行快速检测。结果表明,PMA的最佳处理浓度为3μg/mL,体系中HNB的最优浓度为150μmol/L,所构建的PMA-LAMP-HNB方法对沙门氏菌纯培养物的检测灵敏度为4.6×10^1CFU/mL,对人工污染婴儿配方奶粉中该菌的检测灵敏度为6.3×10^1CFU/g,是传统PCR方法的100倍,且总检测时间不超过1 h 30 min。

基于可视化环介导等温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌

应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立基于颜色判定的快速、灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法.根据金黄色葡萄球菌特异性靶基因SAR0395设计LAMP引物,建立可视化LAMP检测方法.优化的反应体系为:1.6μmol/L内引物(FIP和BIP),0.2μmol/L外引物(F3和B3),4.0 mmol/L MgSO4,1.0 mmol/L dNTPs,0.4 U/μL Bst 2.0 WarmStartTMDNA聚合酶,120μmol/L羟基萘酚蓝,扩增温度60℃,扩增时间60 min.在可视化LAMP体系中添加两条环引物(LF和LB)反应时间可缩短至20 min.该可视化LAMP反应60 min,其基因组灵敏度可以达到0.0103 fg/μL,菌落灵敏度可以达到1.9 CFU/mL;利用46株金黄色葡萄球菌和24株非金黄色葡萄球菌证实该可视化LAMP具有良好的特异性和可靠性.本研究中建立的可视化LAMP可为金黄色葡萄球菌的快速检测提供一种新的技术.

铸铁中的铜和镍的连续快速测定

研究以CTMAB和TritonX-100为增溶剂,以5-Br-PADN为显色剂,在pH为9.7的氨-氯化铵介质下连续测定铜和镍的方法.铜、镍与5-Br-PADN的配合物在547nm处均有较大的吸收,其表观摩尔吸光系数为εCu=3.94×104L/(mol·cm),εNi=3.64×104L/(mol·cm),配合物至少稳定12h,铜、镍分别在0～10μg/10ml和0～8μg/10ml范围内服从比耳定律,方法用于铸铁中的铜和镍的连续测定,快速准确,结果令人满意.

寨卡病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立与应用

本研究建立了一种简单、快速、准确的寨卡病毒可视化逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。在线设计3套LAMP引物,利用实时浊度仪筛选最佳引物,加入羟基萘酚蓝,评估可视化RT-LAMP检测方法的灵敏度和特异性。建立的可视化RT-LAMP方法可检测的最低浓度为101copies/μL,高于普通PCR和荧光定量PCR 1~2个数量级;同时,该方法不与其他虫媒病毒产生交叉反应。该方法可为虫媒监测和临床诊断提供实验依据。

基于环介导等温扩增技术快速检测瓜果腐霉菌

[目的]建立一种快速、准确的检测瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为诊断和防治瓜果腐霉菌引起的植物病害提供技术支撑。[方法]通过比较基因组学方法,在瓜果腐霉菌基因组上筛选有序列特异性的基因作为检测的靶标基因,设计LAMP特异性引物,建立一种基于颜色判定的快速、准确的LAMP检测方法,随后对该检测方法的特异性、灵敏度和发病组织实际检测等进行分析评价。[结果]鉴定到1个编码Trypsin蛋白酶的基因是瓜果腐霉菌特异的基因,以该序列作为靶标建立了LAMP检测方法。在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为指示剂,在等温条件(64℃)下进行核酸扩增反应60 min,即可通过肉眼直接观察结果,HNB显示天蓝色即为阳性反应;同时,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证为梯形条带,也可判定为阳性反应。特异性试验中,建立的LAMP检测方法能将瓜果腐霉菌和其他病原菌区分开。灵敏度试验中,LAMP检测方法的最低检测限为100 pg·μL-1,与Real-time PCR反应灵敏度一样,是普通PCR反应灵敏度的100倍。发病组织实际检测试验中,该LAMP方法能检测出人工接种发病植株中的瓜果腐霉菌。[结论]成功建立了一种适用于基层使用的针对瓜果腐霉菌的快速检测技术,为该菌所致病害的准确诊断奠定了技术基础。