基于蛋白质组学探讨羟基-α-山椒素对糖尿病心肌病的作用机制

目的基于蛋白质组学检测技术,探讨羟基-α-山椒素(hydroxy-α-sanshool,SAN)治疗糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)的作用机制。方法高脂饲料喂养及腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)联合使用建立DCM模型。分为对照组(CON组)、DCM组和SAN治疗组(DCM+SAN组)。小动物心脏超声及病理染色评价小鼠心脏功能及组织形态,蛋白组学技术推测SAN对DCM的作用机制,Western blot实验验证cAMP/PKA信号通路关键蛋白表达水平。结果心脏超声与病理染色显示SAN对DCM小鼠心脏有保护作用。DCM+SAN组与DCM组进行蛋白组学检测,共鉴定160个差异蛋白,127个蛋白表达上调,33个蛋白表达下调;GO二级功能注释显示细胞过程、分子结构和细胞结构等功能;KEGG富集分析显示cAMP信号通路富集最为丰富;蛋白互作网络显示以PKA为中心节点与多种蛋白在cAMP信号通路中有互作关系。Western blot验证DCM组的cAMP和PKA蛋白相对表达量均明显低于CON组(P<0.05);DCM+SAN组的cAMP和PKA蛋白相对表达量均明显高于DCM组(P<0.05)。结论SAN对糖尿病心功能有保护作用,通过cAMP信号通路发挥作用。

羟基-α-山椒素与肌原纤维蛋白互作及其麻味感知机制

花椒中的酰胺类物质羟基-α-山椒素(α-SOH)与蛋白质的相互作用可增强川菜中肉类菜肴的麻味。为明晰肉类加工中二者的结构变化及附着情况,探究热诱导(60,70,90℃)的猪肉肌原纤维蛋白(MPs)与α-SOH的互作机制,并通过分子对接解析α-SOH的麻味激活机制。结果表明,α-SOH可增加α-SOH/MPs复合物的表面疏水性,促进热处理MPs的解聚。α-SOH酰胺基团中的N-H键易与氨基酸残基之间形成稳定氢键,改变蛋白的亚基聚集状态,从而显著减弱SDS-PAGE上大于45 ku的条带。荧光图谱和圆二色谱结果证实α-SOH导致蛋白二级结构由规则向无序状态转变。适度热处理(60℃和70℃)的MPs更易与α-SOH形成复合物,从而降低游离α-SOH含量。分子对接结果显示,α-SOH激活麻味是通过与TRPV1受体上的L681结合产生。本试验阐明MPs与α-SOH的互作机制以及激活麻味的机理,可为肉制品加工中的麻味调控提供理论依据。

HPLC-MS/MS测定花椒及其制品中羟基-α-山椒素

建立了液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定花椒及其制品中羟基-α-山椒素的分析方法。样品经70%甲醇水溶液超声提取2次,每次10 min,以0.1%甲酸水溶液和甲醇为流动相梯度洗脱,经C18色谱柱分离,正离子模式扫描,多重反应监测模式检测。以保留时间和特征离子对(母离子和两个碎片离子)信息比较进行定性,外标法定量。结果表明:在2~500 ng/mL范围内,羟基-α-山椒素的线性回归方程相关系数为0.999;样品添加不同浓度梯度的标准溶液,平均回收率在80.8%~94.4%,相对标准偏差(RSD)在0.8%~4.9%。当样品称取为1 g,定容体积为25 mL时,检出限(LOD)为0.05 mg/kg,定量限(LOQ)为0.1 mg/kg。该方法高效快捷、准确度和精密度满足检测要求,能准确测定羟基-α-山椒素的含量,可为花椒及其制品的质量控制提供参考依据。

花椒及花椒制品中羟基-α-山椒素检测方法

建立花椒及花椒制品中羟基-α-山椒素的紫外分光光度计(UV)测定方法。对羟基-α-山椒素的测定波长、提取试剂、提取试剂体积、提取时间、提取方式、对照品及样品溶液检测稳定性以及检测方法线性、精密度、回收率进行研究。确定提取试剂为乙醇,提取试剂体积100 mL,提取时间15 min,提取方式为超声,对照品及样品溶液在24 h内稳定,方法线性、精密度良好,平均回收率96.8%~97.8%。试验提供一种简便、快捷、稳定、可靠的测定花椒及花椒制品中羟基-α-山椒素的方法。

超高效液相色谱-串联质谱法同时快速测定食用油中9种外源性杂质成分

建立了超高效液相色谱-串联质谱同时快速测定食用油中9种外源性杂质成分的分析方法。样品经乙腈涡旋提取后,采用XSelect~?HSS PFP(100 mm×2.1 mm,3.5μm)色谱柱,以5 mmol/L甲酸铵-乙腈为流动相进行梯度洗脱,在10 min内实现9种待测物的良好分离。在电喷雾正离子模式下,以多反应监测(MRM)模式采集数据并作定性鉴别和定量分析。结果表明,9种待测物在相应的质量浓度范围内线性关系良好,相关系数(r^2)均大于0.996;在3个不同浓度加标水平下,平均回收率为68.2%～104%,相对标准偏差(RSD)为2.2%～12%,检出限(LOD,S/N≥3)和定量下限(LOQ,S/N≥10)分别为0.02～0.10μg/kg及0.05～0.25μg/kg。结果表明,该法简单、快速、灵敏、准确、可靠,适用于食用油中9种难挥发外源性特征杂质的同时快速定性和定量分析。

高效液相色谱法和紫外-可见分光光度法测定竹叶花椒中2种主要成分的含量

目的建立测定竹叶花椒中羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素含量的高效液相色谱法和紫外-可见分光光度法。方法采用高效液相色谱法,色谱柱为Kromasil 100-5 C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-水(40∶60,V/V),检测波长为270 nm,流速为1mL/min,进样量为10μL,测定羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的总含量;采用紫外-可见分光光度法,以羟基-α-山椒素为对照品,于270 nm波长处测定酰胺类物质的总量。结果高效液相色谱法中,羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素进样量分别在0.07911~3.95550μg和0.0095~0.4736μg范围内与峰面积线性关系良好;平均加样回收率分别为97.28%和98.90%,RSD分别为1.79%和1.56%(n=6);紫外-可见分光光度法中,羟基-α-山椒素质量浓度在0.7910~7.9100μg/mL范围内与吸光度线性关系良好,平均加样回收率为95.84%,RSD为0.78%(n=6)。结论所建立的含量测定方法准确、可靠,可用于竹叶花椒药材质量的控制。

基于UPLC-Q-TOF/MS技术的大建中汤血清药物化学研究

目的应用血清药物化学方法分析大建中汤入血成分及体外化学成分。方法采用UPLC-Q-TOF/MS技术快速鉴定大建中汤经大鼠ig给药后吸收入血的原型成分、代谢成分以及体外化学成分,结合UNIFI软件系统分析,根据质谱相对分子质量、裂解规律、文献报道等方法对质谱碎片信息进行分析,表征大建中汤入血成分及体外化学成分。结果在给药血清中检测出22个入血成分,包括5个原型成分和17个代谢产物,体外分析鉴定得到41个化学成分。结论UPLC-Q-TOF/MS技术可实现大建中汤体内外化学成分的快速鉴定,且血清中鉴定出的原型成分和代谢产物可能是大建中汤潜在的活性成分,可为其质量控制研究提供依据。

基于麻味成分的顶坛花椒HPLC指纹图谱研究

目标:不同植物来源及不同干燥方法的花椒麻味成分组成均具有典型的差异性,采用HPLC法建立顶坛花椒基于麻味成分的指纹图谱,为顶坛花椒的地理标志产品识别和质量控制提供了依据。方法:指纹图谱的色谱条件为Phenomenex C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm),甲醇-水梯度洗脱,检测波长270nm,柱温30℃,流量0.70mL/min。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)分析计算顶坛花椒的指纹图谱,采用外标法测定主要麻味组分含量。结果:不同干燥方法得到的顶坛花椒聚类为不同类别。晒干顶坛花椒的HPLC指纹图谱中标定出包括含量最高的羟基-α-山椒素在内的7个共有峰,冷冻干燥顶坛花椒HPLC指纹图谱中标定了包括与前者相同的4个麻味素外,还有高强度麻味组分γ-山椒素等6个共有峰;相同干燥方法得到的顶坛花椒的相似度均大于0.98,表明同一类顶坛花椒产品具有较好的一致性。晒干顶坛花椒的总麻味成分含量高于冷冻干燥顶坛花椒,但与晒干顶坛花椒相比较,冷冻干燥顶坛花椒中的羟基-α-山椒素含量高,并且不同批次都可以稳定检出γ-山椒素,平均含量高于其在晒干顶坛花椒中的含量。结论:基于麻味成分的组成可以将植物来源的相同顶坛花椒根据加工方法的差异聚类为两大类,冷冻干燥方法得到的顶坛花椒与新鲜花椒的麻味组成更接近,高麻味强度组分含量高。基于麻味组分的HPLC指纹图谱区分可以初步判断顶坛花椒产品加工方法,也可以初步与其他花椒品种相区分。

多指标综合评分法优化陕产花椒提取工艺研究

利用Plackett-Burman和Central-Composite Design效应面法优化花椒酰胺提取工艺。建立花椒提取物中总酰胺的紫外检测方法,以此为评价指标进行单因素试验确定影响花椒提取的因素水平;建立花椒提取物中羟基-α-山椒素的高效液相定量检测方法,以提取物重量、提取物总酰胺和羟基-α-山椒素含量三者总评值为指标,筛选对花椒提取影响有显著性的因素,通过响应面法对筛选出的显著影响因素进一步优化花椒酰胺提取工艺。结果表明花椒粉碎粒径65目,以19倍量的80%甲醇在32℃下浸提4h,同时设置搅拌速度50rpm,在此条件下花椒提取物得率为17.91%,总酰胺提取率为6.32%,羟基-α-山椒素提取率为4.99%。验证试验表明优选的花椒总酰胺提取工艺方法可行。

筋骨止痛凝胶中功效物质的体外透皮扩散行为研究

该文探究筋骨止痛凝胶中功效物质的体外透皮扩散规律。采用干加热全自动透皮扩散取样系统,对筋骨止痛凝胶透皮扩散研究方法进行单因素考察,并建立筋骨止痛凝胶透皮接收液中阿魏酸,洋川芎内酯Ⅰ,肉桂酸,羟基-ε-山椒素,羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素6种功效成分的HPLC含量测定方法,对16 h内成分的透皮扩散规律进行研究。试验结果显示,优选筋骨止痛凝胶透皮扩散研究方法为大鼠皮作为透皮屏障,生理盐水作为接收介质,给药剂量0.3 g,采用乙酸乙酯萃取对接收液样品进行处理测定。透皮扩散结果显示,阿魏酸、肉桂酸和洋川芎内酯Ⅰ透皮规律表现为0~8 h释放显著增加,8~16 h释放减缓,释放过程扩散和溶蚀协同进行,阿魏酸、肉桂酸透皮扩散规律遵循Higuchi和Ritger-Peppas方程,洋川芎内酯Ⅰ遵循Higuchi方程。羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素透皮扩散曲线显示16 h内持续释放,释放表现为骨架溶蚀,扩散规律遵循零级方程,一级方程和Ritger-Peppas方程。研究结果表明,筋骨止痛凝胶中功效物质阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、肉桂酸、羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素16 h内释放规律具有一定的缓控释作用,可维持平稳的血药浓度,12 h成分累积透过量能到达24 h的80%,符合其每日2次的临床用药规律。

花椒及其提取物中花椒麻素的HPLC测定方法

试验建立了通过质量吸收系数校准羟基-α-山椒素工作液浓度的方法,解决了花椒麻素标准品不稳定的问题;建立了以羟基-α-山椒素为标样同时测定花椒及其提取物中羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素的高效液相色谱方法,方法采用Agilent Zorbax SB-C18 (4.6 mm×100 mm, 5μm)色谱柱,流动相为乙腈-1%冰醋酸水(40︰60, V/V),流速为1.5 mL/min,检测波长为270 nm,柱温为40℃。羟基-α-山椒素在0.007 84~0.078 4 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系, R2为0.999 8,花椒和花椒提取物的花椒麻素检出限分别为0.005 mg/g和0.05 mg/g,在14.4~54 mg/g范围内加标平均回收率为99.75%,样品检测RSD (N=9)均在1.5%以内。试验评价了三种不同产地和品种的花椒样品,通过对花椒麻素的组成进行分析,得出不同产地和品种的花椒中各种花椒麻素成分比例具有特征性,羟基-γ-山椒素成分比例可以作为鉴别不同产地和品种的特征指标。

基于血清药物化学的花椒温中止痛的质量标志物研究

目的 基于中药质量标志物(quality marker,Q-Marker)概念,在验证花椒温中止痛功效的基础上,分析花椒提取物在正常大鼠及模型大鼠的血中移行成分。方法 采用ig冰水结合冰浴方式建立寒邪犯胃型胃脘痛大鼠模型,并连续ig花椒提取物2周,观察大鼠一般情况,并对全血血细胞计数、脏器指数和胃组织病理变化进行检测。应用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱对对照组、模型组、空白给药组、花椒高剂量组大鼠的血清样本数据进行采集,通过主成分分析和正交偏最小二乘判别法分析花椒温中止痛的潜在物质基础。通过Pharm Mapper反向对接筛选入血成分的作用靶点,并进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析;构建成分-靶点-通路网络图;应用分子对接技术对主要作用通路进行验证。结果 与模型组比较,花椒组大鼠耳廓颜色明显变红,全血白细胞、淋巴细胞及单核巨噬细胞计数明显升高(P<0.05),胸腺指数明显增加(P<0.01);胃组织局部坏死脱落和变性细胞减少。从空白给药组、花椒高剂量组大鼠血清中共鉴定出7个入血成分,其中4个为原型成分(羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-ε-山椒素、二羟基-α-山椒素),3个为代谢产物;其中二羟基-α-山椒素仅存在于花椒高剂量组大鼠血清。花椒入血成分可以通过氢键等形式与过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)信号通路、Th17细胞分化相关的靶点蛋白[脂肪酸结合蛋白3(fatty acid binding protein 3,FABP3)、视黄醇类X受体β(retinoid X receptor beta,RXRB)、FABP7、Janus激酶3(Janus kinase 3,JAK3)]良好结合。结论 花椒可能是通过PPAR、Th17细胞分化信号通路调节免疫系统发挥温中止痛功效;羟基山椒素类化合物可作为花椒温中止痛功效的潜在Q-Marker进行深入研究。

一测多评法同时测定阿娜尔妇洁液中7种成分

目的建立阿娜尔妇洁液中7种成分花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹内酯、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、欧前胡素、蛇床子素的一测多评法,验证该方法在阿娜尔妇洁液质量分析中应用的科学性与可行性。方法采用HPLC法,以花椒毒酚为内参物,建立花椒毒素、异茴芹内酯、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、欧前胡素、蛇床子素的相对校正因子(fs/i),并利用fs/i计算阿娜尔妇洁液中该7种成分的含量,同时采用外标法计算各成分的含量,并比较2种方法差异。结果花椒毒素、异茴芹内酯、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、欧前胡素、蛇床子素的fs/i分别为1.0057、1.2721、2.4210、3.1606、1.2054、1.2993。一测多评法与外标法得到的10批阿娜尔妇洁液样品含量测定结果RSD<2.0%,没有显著差异。结论在对照品短缺的情况下,以花椒毒酚为内参物,建立的一测多评法可用于阿娜尔妇洁液中多指标成分的含量测定和质量评价。

椒姜凝胶贴膏的体外释药动力学与药效学评价

目的:研究椒姜凝胶贴膏的体外动力学并对其药效学进行评价,为该制剂的开发提供可行性依据。方法:采用改良的Franz扩散池法进行体外释放与透皮试验,分别以半透膜和离体小鼠皮肤作为透过屏障,采用高效液相色谱法(HPLC)测定指标成分羟基-α-山椒素、人参皂苷Rb1及6-姜辣素的含量,以评价椒姜凝胶贴膏的释放与经皮渗透效果。6-姜辣素和羟基-α-山椒素检测的流动相为水-乙腈-甲醇(2∶1∶1),检测波长280 nm;人参皂苷Rb1检测的流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(31∶69),检测波长203 nm。建立小鼠肠麻痹模型,动物随机分为5组,即假手术组、模型组、多潘立酮组(3.9 mg·kg^(-1))及椒姜凝胶贴膏高、低剂量组(6.2,3.1 g·kg^(-1),以生药量计),观察椒姜凝胶贴膏对模型动物胃肠推进功能的影响。结果:椒姜凝胶贴膏中羟基-α-山椒素,6-姜辣素及人参皂苷Rb1在24 h的平均释放速率分别为16.41,4.23,4.15μg·cm^(-2)·h^(-1);体外透皮试验中24 h平均透过速率分别为2.31,0.64,0.29μg·cm^(-2)·h^(-1);皮肤滞留量分别为19.56,3.59,1.61μg。根据Ritger-Peppas方程,确定羟基-α-山椒素、人参皂苷Rb1及6-姜辣素的释放为非Fick扩散。椒姜凝胶贴膏高剂量组对模型小鼠小肠摩擦损伤术后的肠功能具有一定改善作用,可以促进肠蠕动,促进小肠推进率(P<0.05)。结论:椒姜凝胶贴膏具有体外释放和透皮性能,体外释放符合Higuchi方程,经皮渗透行为符合零级动力学方程,其对术后的小肠功能有改善作用,可提高小肠推进功能,初步说明该制剂具有一定的临床开发价值。