羟酸还原异构酶基因在啤酒工业酵母中的整合表达

采用PCR技术扩增啤酒工业酵母QY中的羟酸还原异构酶基因ILV5,构建了整合载体YIp 5C,整合转化QY,通过铜抗性筛选转化子,所得的转化子的羟酸还原异构酶的活力明显高于对照菌株QY,转化子产生的双乙酰的量比原始菌株降低了40%.

生物体中的乙酰羟酸还原异构酶

乙酰羟酸还原异构酶是植物、微生物中的支链氨基酸生物合成过程中的一种重要酶。该酶是由两个相同单体组成的同源二聚体。催化乙酰羟酸到α,β-二羟酸的反应,反应中需要NADPH和二价金属离子作辅助因子,酶的活性受到支链氨基酸合成途径中间产物类似物的抑制。

豌豆乙酰羟酸还原异构酶基因结构、蛋白活性分析及其调控机制研究

用PCR方法获得了G2豌豆AAIR基因的核DNA序列,分析表明该基因由8个内含子和9个外显子组成,其中3个内含子带有特征性的富A/T内源启动子区.分子杂交试验表明,短日照条件下G2豌豆中AAIR的表达不受生殖生长的影响,开花前后都维持较高水平的表达.长日照条件下,植株开花后AAIR的表达水平迅速下降.AAIR基因表达强度的变化与豌豆乙酰羟酸还原异构酶的活性变化规律相一致.用乙酰羟酸还原异构酶缺陷型大肠杆菌做功能互补实验发现,带有豌豆AAIR cDNA的细菌能够在缺少分枝氨基酸的M9培养基上生长,表明该基因产物确实具有乙酰羟酸还原异构酶活性.进一步的研究表明,豌豆AAIR基因产物能显著提高野生型大肠杆菌合成分枝氨基酸的能力.凝胶阻滞实验表明,AAIR基因的内含子中的富A/T区能与豌豆核蛋白提取物发生特异性结合.该蛋白在不衰老的短日照G2豌豆顶芽中一直保持稳定表达,但在迅速衰老的长日照豌豆顶芽中,开花后该蛋白就迅速降低直至完全消失.因此,AAIR基因内源启动子区与核蛋白的特异性结合可能是调控该基因表达的重要机制.

豌豆乙酰羟酸还原异构酶基因的cDNA克隆及其表达

用ｃＤＮＡ差示分析法从Ｇ２ 豌豆总ＲＮＡ中筛选到一个ＧＡ＿３特异诱导表达的基因片段，用该片段作探针进一步筛选Ｇ２豌豆ｃ ＤＮＡ文库，得到一个全长２０３６ ｂｐ 的ｃ ＤＮＡ序列．经分析，该ｃ ＤＮＡ含有一个 １７４６ ｂｐ 的可读框，编码的蛋白质含有 ５８１个氨基酸，理论分子量为 ６４ ｋｕ， ｃ ＤＮＡ及推导的氨基酸序列分别与不同来源的乙酰羟酸还原异构酶相应序列有较高的同源性．将该基因转入表达载体中并在大肠杆菌中表达，获得了具有显著酶活性的外源蛋白．