群体感应淬灭酶AiiO的克隆表达及其发酵工艺优化

群体感应淬灭酶AiiO具有降解信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)的活性,从而抑制病原菌的致病性。为提高AiiO表达量,构建了重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-aiiO,对其发酵生产AiiO过程中诱导温度、氮源质量浓度、诱导时机和乳糖添加量进行了优化。结果表明,在诱导温度25℃、蛋白胨20g/L和酵母粉10g/L、发酵初始时添加乳糖、乳糖添加量为5g/L的优化条件下,胞内可溶性AiiO的表达量达到374.26mg/L。

一株假交替单胞菌DL3的抑菌与群体感应淬灭活性研究

本实验室从水产养殖池防污附钢片的微生物黏膜中分离到一株菌DL3,为了明确该菌株的活性及作为有益菌进行应用的可能,通过细菌分离培养、16S rRNA测序和系统发育分析对其做了初步鉴定,并采用牛津杯法、平板法分别测定了菌株的抑菌活性和群体感应淬灭活性。基于菌株DL3 16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,该菌株与解肽假交替单胞菌(Pseudoalteromonas peptidolytica)NBRC 101021T的相似性最高,亲缘关系最近,为99.64%;抑菌试验显示,该菌株对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的抑制作用最强,对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠埃希菌(Escherichi coli)、沙门氏菌(Salmonella)、链球菌(Streptococcus)、志贺氏杆菌(Shigella)、河弧菌(V.fluvialis)、东方弧菌(V.orientalis)、哈维氏弧菌(V.harveyi)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的生长表现出不同程度的抑制作用,且在培养72 h时抑菌活性最强;平板法检测结果表明,菌株DL3具有群体感应淬灭活性,对3-oxo-C6-HSL、C10-HSL、C12-HSL、3-oxo-C14-HSL等信号分子具有较强的淬灭效果。本研究成功分离到假交替单胞菌DL3,并明确了其拮抗病原菌的活性,为后续深入开展菌株DL3及其活性产物的抑菌机制研究、探索海洋微生物在动物细菌性病害防治中的应用奠定了基础。

运动特里顿杆菌的分离鉴定及其抑菌与群体感应淬灭活性检测

为研究海洋源性微生物对细菌性疾病潜在的防控作用,对海水中分离得到的纯化菌株Q165进行16S rRNA基因序列测定和分析,并检测Q165的群体感应淬灭活性和常见病原菌抑菌谱。16S rRNA基因序列测定结果显示,菌株Q165与运动特里顿杆菌(Tritonibacter mobilis)DSM 23403 T相似性为99.47%,与斯氏特里顿杆菌(T.scottomollicae)LMG 24367 T相似性为98.95%,与大西洋鲁杰氏菌(Ruegeria atlantica)CECT 4292 T相似性为97.20%。系统发育分析表明,Q165与运动特里顿杆菌聚为一簇,亲缘关系近,鉴定为运动特里顿杆菌。群体感应淬灭活性检测结果表明,Q165对N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactones,AHLs)信号分子具有降解活性,采用琼脂扩散法测得,Q165能显著抑制金黄色葡萄球菌和鳗弧菌的生长。为菌株Q165及其活性产物的进一步研究和应用奠定了基础。

细菌群体感应淬灭酶的研究进展

细菌的群体感应系统(Quorum sensing,QS)参与许多生物学功能的调控,其中包括动植物病原细菌致病因子的生成以及人类某些病原细菌生物膜的形成。酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL)是调控群体感应系统的关键信号分子。近年的研究表明,不同生物体包括细菌和真核生物中都存在类别不同的能够降解AHL的群体感应淬灭酶(Quorum-quenching enzyme)。在AHL依赖型致病菌和转基因植物中表达AHL降解酶能有效地抑制QS信号分子的积累,从而阻断了病原细菌的发病机制,提高了植物的抗病性。这些新颖的群体感应淬灭酶的发现,不仅为防治细菌侵染提供了可行的途径,也对研究它们在宿主中的功能和对生态系统的潜在影响提出挑战。

彩色马蹄莲细菌性软腐病菌的鉴定及其群体感应淬灭的研究

近几年南京种植的彩色马蹄莲软腐病发生严重,从不同品种的彩色马蹄莲不同部位病组织中分离到6个菌株,经形态特征与培养性状比较、生理生化测试、16S rDNA序列分析和致病性测定,鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorasubsp.carotovora,P.c.c)。信号分子检测结果表明,分离菌株可产生并释放出N-酰基-高丝氨酸内酯(AHLs)类信号分子。利用PCR技术扩增土壤根癌农杆菌中的attM基因,其编码的AttM解酯酶可以显著降解AHLs,在离体条件下可有效地减弱该病原菌的致病性,这为有效控制彩色马蹄莲细菌性软腐病提供了一种新途径。

群体感应淬灭——防治植物细菌病害的新策略

群体感应(quorum sensing,QS)是细菌的一种调控机制,指细菌通过感应特定信号分子的浓度来感知周围环境中自身或其它细菌的数量,并调整相关基因的表达以适应环境的变化。多种植物病原细菌利用QS系统调控致病因子的表达,因此,QS系统可以作为细菌病害防治的新靶点。对细菌QS调控机制的干扰和破坏称为群体感应淬灭(quorum quenching)。本文介绍了QS与植物病原细菌致病性的关系,以及近年来群体感应淬灭研究的新进展。

假单胞菌WX14群体感应淬灭酶基因的克隆及其功能研究

本研究采用报告菌平板法及β-半乳糖苷酶活性测定并筛选到10株具有较强降解酰基高丝氨酸内酯(AHLs)能力的细菌,其中菌株WX14降解AHLs能力较强,且菌体和菌体外泌物均具有降解活性。利用PCR法从菌株WX14中克隆到hac A和hac B两个群体感应淬灭酶基因,基因全长分别为2286和2370 bp,氨基酸序列比对分析结果表明,Hac A属于阿库来菌素A酰化酶蛋白家族,Hac B属于青霉素G酰化酶蛋白家族。这两个基因编码产物均为N末端亲核(N-terminal nucleophile,Ntn)水解酶家族成员。将hac A和hac B导入到软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum后,可减弱该细菌在马铃薯块和白菜上的致病性,因此这2种AHLs降解酶对依赖于群体感应的软腐病有一定防病作用。经16S rDNA序列同源性分析鉴定,3株为假节杆菌Pseudarthrobacter spp.、1株节杆菌Paenarthrobacter sp.、4株假单胞菌Pseudomonas和2株芽胞杆菌Bacillus spp.。

群体感应淬灭酶对副溶血性弧菌影响的综合实验设计

该文设计了以水产致病菌群体感应系统为靶点的新型防治策略实验,构建了群体感应淬灭酶AiiA酶的原核表达系统,测定了重组酶的酶学性质,探究了该酶对副溶血性弧菌群体感应系统的调控以及对其生长、生物膜、蛋白酶、运动能力和毒力基因tlh表达的影响。结果表明重组AiiA酶可抑制副溶血性弧菌胞外基质的产生,减少生物膜的形成,显著降低细菌蛋白酶活性、运动能力并减少毒力基因tlh的表达。该综合性实验结合了基因工程、酶工程、食品贮藏原理等多领域实验技术,有利于提升学生的创新思维和实验技能。

细菌群体感应淬灭酶及其应用研究进展

细菌群体感应(quorum sensing,QS)是细菌的一种密度依赖型信息交流机制。群体感应淬灭(quorum quenching,QQ)能够破坏细菌群体感应系统,阻断细菌的信息交流。本文中,笔者综述了群体感应淬灭酶——酰基高丝氨酸内酯酶(AHL内酯酶)的研究进展,总结了群体感应淬灭在植物病害防治、水产养殖、膜污染以及医学领域的应用研究,旨在为挖掘群体感应淬灭资源和群体感应淬灭的应用提供理论依据与指导。

盐单胞菌Fosmid文库构建及群体感应淬灭酶的筛选

通过构建盐单胞菌Fosmid基因组文库,以求筛选到群体感应淬灭酶(AHL降解酶)。采用改良的SDSCTAB法提取1株盐单胞菌基因组DNA,经平末端连接、包装和转染后,成功构建盐单胞菌Fosmid基因组文库。该文库库容1 700个克隆,平均插入片段约35 kb,共包含约60 Mb的DNA容量,覆盖该菌基因组10倍以上。然后以加X-gal的MM基本培养基筛选AHL降解酶阳性克隆,对文库进行功能驱动的蓝白斑筛选。通过初筛,筛选到3个Fosmid阳性克隆,证实了所构建的Fosmid基因组文库能够应用于AHL降解酶的活性筛选。同时该Fosmid文库亦可进一步用于其他功能基因的开发。

细菌群体感应淬灭酶及其病害防治研究进展

微生物细胞间通过信号分子进行信息交流的现象即群体感应(Quorum sensing,QS),QS广泛存在于微生物群体中,且可以调控特定基因尤其是很多致病基因的表达。群体感应淬灭(Quorum quenching,QQ)是基于群体感应现象提出的新型病害防治策略,即通过抑制信号分子的合成、监测或对信号分子进行酶降解、修饰的途径来干扰群体感应以达到防治病害的目的。利用群体感应淬灭酶(Quorum quenching enzymes)降解微生物信号分子,是目前毒性最小、最为有效的群体感应淬灭途径。迄今为止,多种细菌信号分子的群体感应淬灭酶都已有报道,其中,酰基高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactones,AHLs)和顺-11-甲基-2-癸烯酸(cis-11-Methyl-2-dodecenoic acid)群体感应淬灭酶研究最为深入。综述并分析了群体感应淬灭酶及其病害防治的研究现状、存在的问题和未来研究方向,为今后发展新型绿色安全病害防控措施提供关键理论和技术支撑。

群体感应淬灭酶YtnP对草鱼肠道菌群结构的影响

【目的】揭示群体感应淬灭作用与宿主肠道菌群结构间的作用关系,为具有群体感应淬灭作用益生菌及其淬灭酶在水产养殖上的推广应用提供理论依据。【方法】选取30尾规格为25±1 g/尾的草鱼随机分为对照组和试验组,试验组每尾草鱼腹腔注射100μL溶解稀释后的YtnP(25μg/mL),对照组每尾草鱼腹腔注射等量的300 mmol/L分子筛缓冲液,分别在注射后24和48 h采集草鱼前肠、中肠和后肠的肠道组织及内容物,提取各肠段总DNA及PCR扩增16S rRNA序列V3~V4可变区,然后基于Illumina MiSeq高通量测序技术分析外源添加YtnP对草鱼肠道菌群多样性与丰度的影响。【结果】12份草鱼肠道样品测序共获得原始序列(Raw reads)660205条,有效序列(Valid reads)416614条;对照组和试验组样品的OTU数目分别为142±102和143±67个。在门分类水平上,对照组和试验组草鱼肠道优势菌群均为放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes);相对于对照组,试验组草鱼肠道中浮霉菌门(Planctomycetes)相对丰度显著增加(P<0.05,下同),放线菌门、梭杆菌门和变形菌门的相对丰度也呈升高趋势,但差异不显著(P>0.05,下同),厚壁菌门、TM7和拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度则呈下降趋势。在属分类水平上,对照组和试验组草鱼肠道均以鲸杆菌属(Cetobacterium)和诺卡氏菌属(Nocardia)为优势菌群;相对于对照组,试验组草鱼肠道中鲸杆菌属相对丰度呈升高趋势、诺卡氏菌属相对丰度呈下降趋势,但变化差异均不显著,未特指微杆菌属(UnspecifiedMicrobacteriaceae)相对丰度则显著增加。草鱼肠道菌群结构Alpha多样性分析发现,试验组样品的Chao1和ACE指数低于对照组样品,Shannon和Simpson指数略高于对照组样品,但差异均不显著;Beta多样性分析结果显示,对照组与试验组间的菌群特点存在差异,且组间区分效果明显。【结论】外源添加YtnP不会导致草鱼肠道优势菌群种类发生明显变化,但能在一定程度影响肠道菌群的相对丰度。

申氏杆菌37-1中群体感应淬灭内酯酶AiiS的功能分析

许多植物病原细菌通过群体感应(quorum sensing,QS)系统调控相关毒性因子的表达,而群体感应淬灭(quorum quenching,QQ)是通过干扰QS系统,达到防治植物细菌性病害的重要策略之一。本研究利用原位培养法分离得到2000多株不同菌株形态的植物根围细菌,结合QS系统信号分子检测平板筛选到7株具有QQ活性的候选细菌,其中菌株37-1可完全降解信号分子。16S rDNA序列分析表明,菌株37-1属于Shinella sp.。全基因组序列分析发现菌株37-1中存在一个可能的QQ降解酶编码基因aiiS(autoinducer inactivation gene from Shinella sp.)。系统发育分析表明AiiS属于α/β水解酶家族蛋白。液相色谱-串联质谱分析进一步表明AiiS可水解N-乙酰高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL)类QS信号分子中的内酯健,生成酰基高丝氨酸,因此AiiS属于AHL内酯酶。将aiiS基因导入胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum Z3-3中,可显著降低该菌AHL信号分子和果胶酸盐裂解酶的产生及其在白菜、马铃薯和胡萝卜上的致病性。以上结果表明菌株37-1中AiiS蛋白是一种AHL内酯酶;病原细菌中异源表达aiiS基因可有效干扰相关病原细菌中QS系统的调控功能,表明AiiS蛋白具备开发为潜在新型生防制剂的价值。

群体感应淬灭酶AiiA发酵工艺优化

群体感应淬灭酶Aii A具有降解微生物信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)的活性。利用重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)-p ET-28a-aii A表达Aii A并优化其发酵工艺。对发酵过程中乳糖诱导时机和诱导浓度进行优化,在发酵初始时添加乳糖进行诱导、乳糖诱导浓度为5g/L的情况下,细胞中可溶性目的蛋白Aii A浓度达215.72μg/m L。Aii A的发酵工艺优化为新型生物抑菌剂的生产提供了实验依据。

群体感应淬灭酶LsrK蛋白表达纯化

对群体感应淬灭酶LsrK蛋白进行重组表达及纯化。构建重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET-28a-lsrK,利用乳糖自诱导的方法诱导表达重组蛋白LsrK,并利用亲和层析和凝胶过滤层析进行纯化。LsrK蛋白经凝胶过滤层析后,纯度较高,蛋白浓度达到28.6mg/L发酵液,为进一步进行LsrK蛋白的结构解析及功能研究奠定了基础。

面包乳杆菌ZHG2-1对荧光假单胞菌群体感应的淬灭作用

以紫色杆菌CV026为指示菌株,验证面包乳杆菌ZHG2-1群体感应淬灭活性,检测其对荧光假单胞菌生物膜、致腐因子表型以及相关基因表达水平的影响,探究面包乳杆菌ZHG2-1对荧光假单胞菌群体感应的淬灭机制。结果表明:菌株ZHG2-1无细胞上清液对荧光假单胞菌AHLs的降解活性为100%。在亚抑制质量浓度(1.0,2.0,3.0 mg/mL)下,菌株ZHG2-1粗提物对荧光假单胞菌生物膜的抑制率和清除率分别为在9.66%~31.32%和28.62%~62.82%范围,对胞外多糖、蛋白酶、脂肪酶、生物胺等致腐因子抑制率在7.23%~100%范围,并呈质量浓度依赖性。扫描电镜结果表明亚抑制质量浓度的菌株ZHG2-1粗提物处理使其生物膜量显著减少,细菌菌落处于分散状态。qRT-PCR结果显示,菌株ZHG2-1粗提物对荧光假单胞菌群体感应基因rhlI和rhlR分别下调0.93和0.99,aprX、algA、orm、flgA、ldcA等生物膜和致腐基因的表达水平也被显著抑制,说明面包乳杆菌ZHG2-1通过干扰荧光假单胞菌群体感应基因的表达,影响其生物膜和腐败因子的产生。本研究结果为开发水产品新型生物防腐剂提供理论依据。

基于群体感应的生物膜技术在土壤污染修复中的应用与展望

生物膜修复技术凭借其高效性、安全性和经济性,已被广泛应用于土壤中难降解污染物的去除。其中,群体感应效应在生物膜修复过程中起着至关重要的作用。群体感应是微生物普遍存在的细胞间通讯形式,有助于生物膜内不同细菌种内/种间的信息交流,使微生物能够在“群体水平”上相互协作,能够调控生物膜胞外聚合物的生成以及对污染物的吸附固定与降解。本文在简要介绍生物膜和群体感应的功能和作用基础上,结合近年来群体感应调控生物膜形成以及对污染物的降解基础上,综述了群体感应在生物膜修复技术中的应用,最后对生物膜群体感应系统在污染土壤修复中的工程化设计进行了展望。

土壤中群体感应淬灭细菌的原位分离与筛选

【背景】许多革兰氏阴性细菌通常以N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactones,AHLs)作为群体感应主要的信号分子。【目的】从土壤中筛选和鉴定新型群体感应淬灭细菌。【方法】通过"垫圈法"从土壤中原位培养分离细菌,采用琼脂条法、报告菌平板法及β-半乳糖苷酶活性测定筛选群体感应淬灭细菌,根据16S rRNA基因序列同源性分析确定菌株系统发育地位。【结果】从不同地区土样中原位培养共分离获得细菌502株。以根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4)作为报告菌,最终得到11株具有较强降解AHLs能力的细菌,包括假单胞菌5株、不动杆菌4株、变形杆菌和莱茵海默氏菌各1株。大部分细菌可完全降解N-3-羰基十二酰基高丝氨酸内酯(3OC12-HSL),部分细菌对N-(3-氧代己酰)高丝氨酸内酯(3OC6-HSL)和N-3-氧代辛酰高丝氨酸内酯(3OC8-HSL)具有一定降解活性。【结论】Proteus和Rheinheimera可降解AHLs,为今后防治依赖群体感应的植物细菌病害提供新型生防资源。

不动杆菌3-59中群体感应信号分子淬灭酶基因克隆及其生物信息学分析

N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)在许多植物病原细菌中作为群体感应信号分子调控致病因子的表达。在淬灭群体感应系统中,AHL可控制依赖于群体感应的植物细菌病害。以实验室保存的4个群体淬灭酶产生菌为研究对象,对β-半乳糖苷酶活性进行测定,结果表明菌株3-59对信号分子降解能力最强。根据16SrDNA相似性,将该菌株鉴定为不动杆菌(Acinetobactersp.)3-59。采用PCR法从菌株3-59中克隆到AHL淬灭酶基因aciJ,该基因全长1 491bp,编码496个氨基酸,预测分子量约为55.69ku,估测等电点为9.52。氨基酸序列比对结果显示,其与不动杆菌的单加氧酶相似性在90%以上。AciJ蛋白有跨膜结构域,N端无信号肽,有1个糖基化位点位于285位,有43个磷酸化位点均匀分布于整个多肽链中。

群体感应淬灭菌的分离及其膜污染控制性能

通过淬灭细菌的群体感应系统来抑制生物膜形成、防止膜生物污染的方法近年来受到广泛关注.本实验从实际运行污水处理厂活性污泥中分离出5株具有群体感应淬灭功能的菌株,其中菌株HG10对信号分子N-乙酰高丝氨酸环内酯(C6-HSL)分解能力最强.经16S rRNA基因序列比对,初步鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus).用海藻酸钠将菌株HG10进行包埋固定,以探究其在膜过滤系统中对膜污染防治的效果.结果表明,经过8 d培养,添加细菌包埋珠(SA-HG10)的实验组B中膜通量为181.29 L·(m^2·h)^(-1),未投加包埋珠的对照组A膜通量为110.64 L·(m^2·h)^(-1),B组膜通量比A组高出63.86%;对微滤膜片上生物膜中EPS含量测定表明,实验组B中EPS多糖和蛋白质含量较对照组A分别减少了29%和48%,疏水性蛋白质含量的大量减少是造成膜污染减弱的主要原因;膜表面胞外聚合物(EPS)总含量减少了43%,表明投放SA-HG10细菌包埋珠对过滤膜片上生物膜形成具有明显抑制作用,改善了膜过滤性能.