N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素-O-乙酸酯柱前衍生HPLC分离荧光检测肽及其水解产物

探索了N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素-O-乙酸酯(SIFA)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)、三甘肽(Gly-Gly-Gly)、二甘肽(Gly-Gly)和组成它们的氨基酸-谷氨酸(Glu)、胱氨酸(Cys2)、甘氨酸(Gly)反应的衍生条件以及其衍生物的色谱分离条件。于含pH8.5的0.2 mmol/L H3BO3-Na2B4O7缓冲溶液中衍生25 min,衍生反应液直接进样,采用C18柱,以含42％甲醇的pH5.0 10mmol/L H3cit-Na2HPO4缓冲溶液为流动相,在λex/λem=492/513 nm处荧光检测,分离测定了六种肽及其组成氨基酸的衍生物,检出限为O.64～12 fmol。该方法具有流动相体系简单、灵敏度更高等优点。

羧基荧光素琥珀酰亚胺酯标记肿瘤细胞及其在细胞毒检测中的价值

目的探讨化学染料羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDA-SE）标记肿瘤细胞的最佳条件及其在细胞毒检测中的价值。方法用不同浓度的CFDA-SE标记K562（人红白血病细胞）、YAC-1（小鼠淋巴瘤细胞）、A375（人乳腺癌细胞）、MCF-7（人黑色素瘤细胞）不同肿瘤细胞系，并检测其0—24h的荧光强度，观察荧光强度变化的时间动力学，选择CFDA-SE标记细胞的最佳浓度；CFDA-SE标记细胞后孵育时间为1—6h，再用DNA染料碘化丙啶（PI）标记，流式细胞仪分析CFDA-SE和PI双标记细胞，并计算细胞死亡率，研究CFDA-SE对细胞的毒性。CFDA-SE标记时间分别为5、6、7、8、10、15min，测定标记不同时间的荧光强度和细胞的死亡率，选择最佳标记时间；用CFSE在最佳条件下标记靶细胞进行细胞毒检测实验。结果对于不同肿瘤细胞系，CFDA-SE标记的最佳浓度不同；CFDA-SE对细胞没有毒性，死亡率低于5％；最佳标记时间为8min。人外周血单个核细胞和BALB／c鼠脾淋巴细胞对肿瘤细胞K562、YAC-1均表现出杀伤活性，杀伤百分率随效靶比和共孵育时间的增加而增加。最佳效靶比为50：1—25：1，共孵育时间为2—4h。结论CFDA-SE具有标记细胞稳定，能用于细胞培养时间较长的研究，不影响细胞功能，适用于流式细胞仪检测细胞毒实验的优点，是一种很好的标记细胞的荧光素染料。

5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯直观检测经交联处理异体组织的交联程度研究

利用荧光技术创建一种新的方法评价经交联处理异体组织的交联程度。以新西兰兔胸主动脉作为研究对象,按与其作用的戊二醛(GA)浓度不同分为空白对照组--未与GA作用(A组),GA浓度0.625%组(B组),GA浓度1.25%组(C组),GA浓度2.5%组(D组),各组与GA交联作用后经5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(5-FAMSE)处理,然后在荧光显微镜下照相,照片进行荧光强度分析(应用专业图像分析软件--Image-Pro Plus 6.0),结果A组>B组>C组>D组,各组之间差异具有显著统计学意义(P<0.01)。各组同时取一定量血管组织经GA交联后提取其组织蛋白,进行传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PGE)与5-FAMSE法进行对照,结果组织蛋白提取量A组>B组/C组/D组,无法定量比较B、C、D各组间差异。以上可说明5-FAMSE是一种有效的荧光试剂,可以清楚地反映小血管氨基残端的变化,可以更为方便且直观的评价经GA处理的小血管的交联程度。

流动注射化学发光法测定氨基乙酸的研究

实验研究了影响化学发光信号强度值的各种因素，初步探讨了体系产生化学发光的可能机理。在优化的实验条件下，氨基乙酸在1．0×10^-7～1．0×10^-4kg·L^-1的质量浓度范围内与化学发光信号强度呈良好的线性关亲．检出限（3σ）为3×10^-8～kg·L^-1。对质量浓度为1．0×10^-6kg·L^-1的氨基乙酸溶液连续测定11次。相对标准偏差（RSD）为2．8％，将该方法用于氨基乙酸模拟样品的分析，结果满意。

α-芋螺毒素AnIB[A11G]荧光标记的合成及应用

目的:合成α-芋螺毒素AnIB[A11G]荧光标记物,并用于测定烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)α3β2在小鼠脑内的分布。方法:利用两步氧化法设计合成α3β2高选择性抑制剂AnIB突变体AnIB[A11G],纯化后,用5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯(5-TAMRA-SE)标记,标记物鞘内注射到小鼠脑内,用激光扫描共聚焦显微镜测定α3β2在小鼠脑内的分布。结果与结论:获得了单一5-TAMRA-AnIB[A11G]荧光标记物,测定表明小鼠脑内nAChRα3β2主要分布于海马区域。

流式细胞术检测CFSE标记人T细胞亚群增殖反应

目的探讨应用流式细胞术和活细胞荧光染料CFSE检测T淋巴细胞各亚群增殖反应的方法学。方法人外周血单个核细胞(PBMC)经CFSE染色后,分别用植物凝血素(PHA)、CD3mAb和结核杆菌抗原(Mtb-Ag)刺激,加IL-2扩增后,用流式细胞术检测活化增殖后T细胞各亚群的比例,并用ModFit软件分析各亚群的增殖动力模型。结果PHA和CD3mAb主要活化总T细胞,CD8+T细胞的增殖优于CD4+T细胞,但CD4+T细胞前4代细胞明显多于CD8+T细胞。Mtb-Ag主要刺激γδT细胞增殖。结论以CFSE标记淋巴细胞,结合流式细胞术可有效检测出不同T细胞亚群对不同刺激剂的增殖反应以及增殖动力学变化。

人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体外模型中黑素小体转运的观察

目的:建立人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养的体外模型,并且在模型中观察黑素小体的转运。方法:分别培养人表皮黑素细胞和角质形成细胞,用二乙酰羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)标记黑素细胞内黑素小体,然后将两种细胞共培养,并在倒置显微镜和共聚焦显微镜下观察共培养模型中黑素小体由黑素细胞向角质形成细胞的转运。结果:培养至第3天和第7天可在倒置显微镜下观察到黑素细胞与角质形成细胞共同存活,并通过树突发生联系,在共聚焦显微镜下可直接观察到黑素小体由黑素细胞向角质形成细胞的转运。结论:成功建立黑素细胞与角质形成细胞共培养的体外模型,并利用CFDA-SE标记,在共聚焦显微镜下直接观察到黑素向角质形成细胞的转运。

白消一号方作用于黑素瘤细胞与角质形成细胞共培养模型中黑素小体转运的观察

目的体外建立黑素瘤细胞与角质形成细胞直接接触的培养模型,观察白消一号方对此模型中黑素小体转运的影响,探讨其治疗白癜风的药理作用。方法体外培养黑素瘤细胞和角质形成细胞,用二乙酰羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)标记黑素瘤细胞内的黑素小体,然后将标记的黑素瘤细胞与角质形成细胞共同培养。大鼠中药灌胃后取血清加入此模型中,在倒置显微镜下观察混合细胞模型生长及共聚焦显微镜下观察共培养模型中黑素小体由黑素瘤细胞向角质形成细胞的转运情况。结果含药血清可使黑素小体由黑素瘤细胞向角质形成细胞的转运增加。结论在共聚焦显微镜下观察到白消一号方可以促进黑素小体转运,此途径可能为白消一号方治疗白癜风的作用机制之一。

毛细管电泳分离-激光诱导荧光检测巴氯芬和加巴喷丁

采用新合成的6-氧-(N-琥珀酰亚胺乙酸酯)-9-(2'-甲氧羰基)荧光素(SAMF)作为柱前衍生试剂,用甘氨酸做内标,毛细管电泳分离-激光诱导荧光检测血清中的巴氯芬(baclofen)和加巴喷丁(gabapentin).研究表明,在磷酸盐缓冲溶液(pH=8)介质中,25℃下15 min即可完成衍生反应.以pH=5的30 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液作为电泳介质,衍生产物在16 min内达到电泳基线分离,检出限为4×10-10 mol/L.将新建立的方法用于血清中巴氯芬、加巴喷丁的分析测定,回收率为95.5%～102.01%,结果令人满意.

CFDA—SE和Hoechst两种荧光标记技术在嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤中的应用

目的将CFDA-SE和Hoechst两种常用的细胞荧光标记技术在嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤中的应用进行比较,选出一种更适合的方法进行推广.方法取20只脊髓完全横断的SD大鼠,其中10只移植用CFDA—SE标记的嗅鞘细胞,另10只移植用Hoechst标记的嗅鞘细胞。结果两种标记方法都能成功标记上,但Hoechst对移植后组织的污染率较高,CFDA—SE染色清楚,对受区组织干扰较少.结论CFDA—SE相比Hoechst在嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤中进行荧光标记更清楚、更准确,值得推广。

利用荧光染料CFSE分选衰老细胞的探究

目的:探究利用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)进行衰老细胞分选的可行性。方法:利用CDK4/6抑制剂LY2835219诱导人口腔鳞癌细胞Cal27衰老,在LY2835219撤药后立即进行CFSE染色,避光培养,并在撤药后第0、2、4、6、8天进行衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色。通过流式细胞仪分选CFSE荧光强度高的细胞,进行SA-β-gal染色。结果:CFSE荧光标记的细胞与SA-β-gal染色阳性的细胞相一致。撤药后第4、6天利用CFSE荧光进行流式分选,CFSE-high组的细胞SA-β-gal阳性率显著高于未分选组(P<0.05)。结论:利用CFSE分选衰老细胞具有可行性,可获得活的衰老细胞。

在动物模型脏器中动态追踪荧光染料标记的目标细胞

目的 利用染料羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDA-SE）标记细胞,通过测定荧光信号强度计算细胞数量,作为追踪移植细胞进入模型动物体内后分布情况的方法.方法 采用CFDA-SE标记不同类细胞,荧光显微镜计数染色率,台盼蓝计数存活率,酶标仪检测荧光信号,确定不同种类、同种细胞不同状态下及模拟动物体内细胞数与荧光信号之间的线性关系,制作标准曲线,确定利用该染料作细胞计数的可行性.将CFDA-SE标记细胞经脾脏注入小鼠体内,于3h、6h、12h、24h处死小鼠,检测肝脏信号,根据标准曲线定量计算肝脏内该细胞动力学特征.结果 CFDA SE括记细胞后,荧光信号与细胞数相关性较好,24h内随时间增加荧光信号有所增高,但与细胞数相关性不受影响.加入小鼠内脏组织匀浆后,荧光信号值有所降低,但与细胞数的相关性不受影响.结论 CFDA-SE可标记活细胞,操作简单,标记率高,注入体内后,通过严格制作标准曲线,检测脏器荧光信号,可定量确定细胞在体内脏器的的动态分布,方法简单可靠.

CFSE标记的淋巴细胞增殖实验检测方法的建立

目的建立基于流式细胞术和活细胞荧光染料CFSE的淋巴细胞增殖、单向混合淋巴细胞实验的免疫学检测方法。方法分离单个核细胞,将反应细胞经CFSE染色后,分别加入不同的淋巴细胞增殖刺激物或与灭活的异基因淋巴细胞共培养。培养后细胞经流式细胞术检测标记细胞是否增殖,应用CD4-PE抗体检测增殖细胞中CD4阳性T细胞亚群比例,ModFit软件分析增殖动力模型。计算增殖CDI或PI指数。结果基于CFSE建立的淋巴细胞增殖实验,经不同刺激物或异基因抗原刺激后增殖指数明显升高,使用CD4-PE抗体进行再次标记后可以对增殖实验中CD4阳性淋巴细胞亚群的增殖进行评估。结论成功建立了基于CFSE标记淋巴细胞的增殖实验检测方法,该方法简单、实用、灵敏度高,可以取代3H或MTT用于不同条件、不同免疫刺激情况下淋巴细胞增值的检测或评估。

TGF-β1诱导的新生儿脐带血CD4^+CD25^+调节性T细胞增殖动力学研究

目的:探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的新生儿脐带血CD4+CD25+调节性T细胞增殖活性。方法:新生儿脐带血单个核细胞经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFSE)标记后,加入TGF-β1,同时用CD3mAb激活和IL-2培养扩增。培养第4、6、8天收集细胞,用流式细胞术检测活化增殖后的CD4+CD25+、CD8+T细胞增殖动力学变化。结果:培养后第6、8天,实验组CD4+CD25+T细胞增殖指数分别为11.52、23.04,高于对照组CD4+CD25+T细胞(6.68,10.46)及实验组CD8+T细胞(4.23,5.43)。培养后第8天,实验组CD4+CD25+T细胞第8代到第10代所占的比例为52.74%,在各代中以第8代所占比例最高,而对照组CD4+CD25+T细胞第8代到第10代所占的比例为36.26%;实验组CD8+T细胞第8代到第10代所占的比例为13.54%,在各代中所占比例最高的为第2代,而对照组CD8+T细胞第8代到第10代所占的比例为29.44%。结论:TGF-β1诱导的新生儿脐带血CD4+CD25+调节性T细胞增殖活性明显强于CD8+T细胞。

新型免疫状态定量监测皮肤移植模型小鼠的特异性

背景:器官移植后如何监测受者的免疫状态,并预测排斥反应的发生,从而调整免疫抑制剂的用量是当前面临的重要问题。目的:探索新型免疫状态定量监测方法在小鼠皮肤移植模型中是否有抗原特异性。方法:建立C57→BALB/c皮肤移植排斥模型,分别输注C57/BALB/c混合脾细胞悬液及第三者对照DBA/BALB/c混合脾细胞,在细胞输注后检测2种混合细胞悬液比例变化及供体细胞杀伤率,同时设置BALB/c→BALB/c同系皮肤移植对照组,免疫低下裸鼠对照组及免疫抑制剂对照组与之对比。结果与结论:C57/BALB/c悬液-移植排斥模型组和C57/BALB/c悬液-移植排斥模型免疫抑制剂组小鼠对供体C57脾细胞有强烈的特异性杀伤作用,其中C57/BALB/c悬液-移植排斥模型免疫抑制剂组特异性杀伤作用稍弱,而输注第三者对照DBA/BALB/c混合脾细胞的小鼠细胞注射2～4h内没有明显特异杀伤作用,但免疫低下的裸鼠始终未表现出特异性杀伤。说明实验建立的抗原特异性免疫状态检测方法能够快速地检测出皮肤移植受体的免疫状态。

干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393在鼠消化道内定植能力及分布规律的研究

研究了干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393在小鼠肠道中定植能力及分布规律。利用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯分子探针对干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393进行标记,以每只1010mL-1的量,口服途径喂给BALB/c鼠,分别于口服后的第1,3,5,6 d取其十二指肠、空肠、回肠、结肠等肠段,通过流式细胞仪检测肠内的标记阳性菌。实验结果显示:经口服后第5 d,干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393开始在BALB/c鼠肠道中定植,在十二指肠、空肠、回肠、结肠的定植率分别为28.70%,29.77%,15.63%,26.17%,第6 d标记的阳性菌出现明显的生长趋势,阳性检出率分别为71.77%,57.31%,65.44%,53.13%。研究表明干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393具有良好的肠道定植能力。

mIL-21基因转染的Sp2/0瘤苗细胞的抗肿瘤机制探讨

目的:探讨小鼠IL-21瘤苗-Sp2/0-mIL-21抗肿瘤效应的机制。方法:用流式细胞术检测Sp2/0-mIL-2瘤苗细胞表面MHC-Ⅰ类分子及CD80分子的表达。以瘤苗细胞接种BALB/c小鼠,以CFSE,7-AAD标记,用流式细胞术检测NK细胞、CTL的细胞毒活性。观察肿瘤组织中淋巴细胞的浸润。用RT-PCR检测肿瘤组织中CXC家族趋化因子I-TAC的表达。结果:与对照组相比,瘤苗细胞膜表面MHC-Ⅰ类分子的表达明显上调。瘤苗接种组小鼠NK细胞、CTL的细胞毒活性明显增强。病理分析发现,肿瘤组织中有较多的淋巴细胞浸润并检测到干扰素诱导的T细胞α趋化因子(I-TAC)的表达上调。结论:肿瘤细胞瘤苗Sp2/0-mIL21可增强小鼠的细胞免疫作用,其抗肿瘤机制可能与T细胞的增殖、活化,促进NK细胞的分化成熟,淋巴细胞向肿瘤组织浸润,以及增强NK细胞和CTL的细胞毒活性有关。

单纯疱疹病毒1型截短糖蛋白B基因疫苗的构建及其诱导小鼠细胞免疫应答

目的：构建、制备单纯疱疹病毒1型截短糖蛋白B DNA疫苗，检测其诱导机体产生的细胞免疫应答效果。方法：利用PCR技术从HSV-1 SM44毒株基因组中扩增出编码HSV-1 gB14-507氨基酸序列的一段基因。定向插入真核表达质粒pcDNA3载体中，构建出重组真核表达质粒pcDNA3-gBt，并对其进行酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定。于BALB/c鼠注射免疫3次，抗体分析CD4＋、CD8＋T细胞亚群的变化，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）/碘化丙碇（PI）双标记的流式细胞计数法检测CTL活性。结果：PCR及测序鉴定结果显示，插入的克隆基因与GenBank中HSV-1F株gB基因序列一致，证实了HSV-1 gBt核酸疫苗的构建；pcDNA3-gBt免疫组BALB/c鼠的CD4＋T细胞数较空质粒（pcDNA3）对照组和生理盐水对照组增加，CTL活性也较对照组明显增强，但是pcDNA3-gBt免疫组BALB/c鼠的CD8＋T细胞、CD4＋/CD8＋T细胞比值与对照组比较差异均无显著性（P〉0.05）。结论：HSV-1 gBt核酸疫苗诱导较强的细胞免疫应答。

小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性检测方法的建立

目的在建立既能保留人肿瘤生物学特性的,且免疫功能相对正常的人肿瘤异种移植动物模型的过程中,为保证小鼠脾淋巴细胞对人肿瘤细胞杀伤作用的考察效率,摸索建立基于流式细胞术的评价小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性的方法。方法用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记人HepG2细胞,利用无水乙醇模拟杀伤人HepG2细胞,用碘化丙啶(PI)染色,流式细胞仪检测,确定CFSE和PI的浓度及作用时间。以小鼠脾细胞为效应细胞,人HepG2细胞为靶细胞,从效靶作用时间和效靶比方面进行优化,确定试验方法的最佳条件。结果采用CFSE/PI双标记将细胞分为CFSE^+PI-、CFSE^+PI^+、CFSE-PI^+和CFSE-PI-4个组群,可有效区分活细胞和被杀伤细胞。CFSE标记靶细胞的浓度采用2.5μmol/mL,效靶作用时间为12 h,效靶比10∶1。结论建立了基于流式细胞术的评价小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性的方法,该方法的建立可为评价动物脾淋巴细胞对异种细胞的杀伤作用提供参考。

CFSE标记法分析番鸭呼肠孤病毒感染对番鸭回肠淋巴细胞归巢的影响

旨在建立一种可靠的体外活番鸭淋巴细胞的荧光标记方法,并用于分析番鸭呼肠孤病毒感染对雏番鸭回肠淋巴细胞归巢的影响。选择活细胞荧光染剂5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE,CFSE)对分离的番鸭淋巴细胞进行标记和利用流式细胞术对体外标记的淋巴细胞体内示踪检测分析,并利用该方法对MDRV感染雏番鸭回肠组织的淋巴细胞数量进行流式细胞术和石蜡切片免疫荧光检测分析;结果最终确定CFSE体外标记番鸭淋巴细胞的条件为以PBS为孵育液,终浓度10μmol·L^-1,37℃30 min;试验结果表明番鸭外周血内的CFSE+淋巴细胞率基本稳定在2%~5%,CFSE^+淋巴细胞峰值出现顺序依次为脾、空肠、回肠、盲肠、十二指肠、法氏囊和胸腺;此外,感染MDRV后1~10 d MDRV组中CFSE+淋巴细胞率极显著(P<0.01)高于MOCK组,该结果与α4+淋巴细胞率和石蜡切片免疫荧光检测结果一致。结果表明本试验CFSE标记的淋巴细胞可用于体内淋巴细胞示踪,初步应用结果提示MDRV感染促进番鸭淋巴细胞向回肠归巢,为进一步阐明MDRV感染的肠道组织致病机制奠定了基础。