金龟子绿僵菌羧基转运蛋白基因MaJEN1及其启动子的克隆与分析

用YADE法扩增了球孢白僵菌T DNA插入突变体T1 2 中与T DNA左边界相连的基因组序列。在此基础上得到了金龟子绿僵菌的羧基转运蛋白的全长cDNA ,MaJEN1。MaJEN1全长 16 95bp ,其中含有长为 15 2 4bp的开放阅读框 (ORF) ,编码 5 0 8个氨基酸的蛋白。氨基酸序列与粗糙脉孢霉和啤酒酵母菌的羧基转运蛋白JEN1相似性分别为 6 9%和 31%。采用PCR扩增得到了MaJEN1的基因组序列GMaJEN1,序列分析发现 ,GMaJEN1含有两个内含子。Southern杂交发现GMaJEN1在金龟子绿僵菌基因组上为单拷贝。利用RT PCR法对MaJEN1的表达特性进行了分析 ,结果表明MaJEN1在蟑螂壳诱导培养基中表达 ,在该培养基中的表达受葡糖糖抑制。进一步采用YADE法得到了长为 16 2 6bp的GMaJEN1上游序列 ,其中含有可能的葡萄糖抑制调控序列。

球孢白僵菌羧基转运蛋白基因BbJEN1及其上游序列的克隆与分析

在分析一株球孢白僵菌T DNA插入突变体T12的Tagging序列的基础上 ,根据与其具有高度同源性的一条金龟子绿僵菌EST序列 (编号为AJ2 732 2 6 )设计简并引物 ,用YADE法从球孢白僵菌中扩增出该EST的同源序列及其延伸序列。序列分析表明 ,该片段与粗糙脉孢霉的羧基转运蛋白JEN1具有高度同源性 ,由此确定该序列为球孢白僵菌羧基转运蛋白JEN1基因的部分序列。然后利用YADE法延伸扩增该序列的上、下游序列 ,获得球孢白僵菌羧基转运蛋白JEN1的全长DNA序列 ,命名为GBbJEN1。利用 3′ RACE扩增出球孢白僵菌羧基转运蛋白JEN1的cDNA序列 ,命名为BbJEN1。BbJEN1全长 16 5 6bp ,编码 5 14个氨基酸的蛋白。推测蛋白分子量为 5 5 975 .37Da,等电点 9.32。氨基酸序列与金龟子绿僵菌、粗糙脉孢霉和酿酒酵母羧基转运蛋白JEN1的同源性分别为 77%、6 6 %和30 %。序列分析表明 ,GBbJEN1含有 2个内含子。Southern杂交表明 ,GBbJEN1基因在球孢白僵菌基因组中为单拷贝。利用RT PCR法对BbJEN1的表达特性进行了分析 ,结果发现BbJEN1基因的转录受蟑螂壳、蝉蜕等昆虫体壁的诱导 ,受葡萄糖的抑制。进一步利用YADE法获得了长为 977bp的GBbJEN1上游序列 ,其中含有可能的葡萄糖抑制调控序列和压力反应元件。

人钠/二羧基转运蛋白2融合蛋白载体的构建及其原核表达

目的 :观测和鉴定人钠 /二羧基转运蛋白 2 (hSDCT2 )在大肠杆菌中的表达 ,并分离、纯化其蛋白产物。方法 :应用DNA重组技术 ,构建重组表达质粒pGEX hSDCT2 ;IPTG诱导其表达。采用谷胱甘肽偶联的Sepharose 4B亲和层析纯化GST hSDCT2 ,经FactorXa酶切和二次亲和层析后 ,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和WesternBlotting进行鉴定。结果 :成功构建hSDCT2基因融合蛋白载体 ,SDS PAGE及WesternBlotting显示GST hSDCT2融合蛋白表达于原核细胞 ,蛋白产量约占菌体总蛋白量的 2 5 %。经酶切及二次纯化后 ,获得纯化的hSDCT2蛋白。结论 :人钠 /二羧基转运蛋白 2可在大肠杆菌中稳定表达。

人钠/二羧基转运蛋白1在肾组织的表达变化及其与肾结石发病的关系

目的 研究肾组织钠 /二羧基转运蛋白 1(hNaDC1)表达变化与肾结石发病的的关系。方法 85例肾结石患者分为、尿枸橼酸正常结石组和低枸橼酸尿结石组。并设 5 0例对照为非结石患者。采用RT PCR及Northern印迹法检测其中部分肾结石患者肾组织的hNaDC1mRNA水平 ;免疫组化检测hNaDC1蛋白表达的变化 ;常规生化方法测定血、尿枸橼酸、草酸等生化指标。结果 低枸橼酸尿结石组结石复发率 (36 .1% ) ,显著高于尿枸橼酸正常结石组 (16 .3% ,P <0 .0 1)。hNaDC1mRNA在正常肾组织中有表达 ,分布于近端肾小管刷状缘 ;低枸橼酸尿结石患者hNaDC1mRNA/18sRNA比值 (0 .6 5± 0 .2 1)显著高于对照组 (0 .36± 0 .11,P <0 .0 1) ;而尿枸橼酸正常结石患者 (0 .4±0 .13)与对照组比较差异无显著意义 (P >0 .0 5 ) ;低枸橼酸尿结石组hNaDC1蛋白表达也显著高于对照组及尿枸橼酸正常结石组 (P <0 .0 1) ,而后两组间差异无显著意义 (P >0 .0 5 )。低枸橼酸尿结石组尿pH值、尿钠水平显著低于尿枸橼酸正常结石组和对照组 ;尿钙、尿草酸水平均显著高于对照组 ,与尿枸橼酸正常结石组无显著差异。结论 肾组织hNaDC1表达上调可能是低枸橼酸尿的重要原因 。

肾小管基底侧钠/二羧基转运蛋白随增龄的表达变化

目的 观察大鼠及人类肾小管基底侧钠 /二羧基转运蛋白 (NaDC3)随增龄的表达变化规律 ,并探讨其在肾脏衰老变化中的意义。方法 采用Northern杂交、Western印迹及免疫组化染色方法 ,从基因及蛋白质水平观察大鼠出生后 1d、7d、1个月、3、12、2 4个月及少年、中青年、老年正常人肾组织NaDC3表达变化趋势 ,并利用生化方法测定大鼠血、尿枸橼酸。结果 ( 1)大鼠血及尿枸橼酸浓度随鼠龄增长呈现逐渐下降的趋势。 ( 2 )大鼠肾组织Northern杂交及Western印迹结果显示随鼠龄增长NaDC3mRNA及蛋白表达逐渐增强的趋势。 ( 3)免疫组化结果显示NaDC3表达于大鼠及人肾脏近端小管基底侧 ,从大鼠出生后 7d开始表达 ,后随鼠龄增长表达逐渐增强 ;在人类随年龄增长也呈现表达逐渐增强的趋势。结论 NaDC3可能通过枸橼酸等物质的能量代谢机制参与了机体的衰老过程。

肾结石大鼠钠/二羧基转运蛋白1的表达及枸橼酸钾防治机制的研究

目的 研究肾组织钠/二羧基转运蛋白1(SDCT1)与低枸橼酸尿的关系以及枸橼酸钾的干预作用,探讨肾结石发病的分子机制和防治措施。方法 雄性Wistar大鼠分为对照组、肾结石组及枸橼酸钾干预组。血、尿枸橼酸和草酸采用酶法测定,Northern blot检测大鼠肾组织SDCT1mRNA水平的改变,免疫组织化学观察SDCT1在肾组织的分布及表达变化。结果 与对照组比较,肾结石组第3天尿草酸水平显著升高,枸橼酸水平显著降低,同时肾组织SDCT1mRNA及其蛋白水平上调。第7天SDCT1mRNA及其表达产物增加更为显著,同时尿枸橼酸水平进一步降低,尿钙排泄显著增加,87.5％大鼠有中-大量的草酸钙结石形成。第14天上述改变更为明显,结石形成率达100％。枸橼酸钾干预组各时间点尿草酸水平与肾结石组差异无显著性意义,但尿枸橼酸水平显著高于肾结石组及对照组,肾组织SDCT1mRNA及蛋白表达显著低于肾结石组,与对照组差异无显著性意义;结石形成率显著低于肾结石组;肾小管扩张、炎细胞浸润等病变也明显减轻。结论 肾组织SDCT1表达上调可能是低枸橼酸尿的重要原因,与肾结石的形成有密切关系。枸橼酸钾可下调肾结石大鼠肾组织SDCT1的表达,对肾结石的形成具有明显的干预作用。

球孢白僵菌羧基转运蛋白基因RNA干扰的沉默效应

羧基转运蛋白基因是近年来分离出的新基因,在虫生真菌中可能与穿透昆虫体壁时的能量代谢有关。构建了针对该基因的双链RNA干扰载体,采用芽生孢子转化法将载体质粒转入球孢白僵菌,并通过RT-PCR检测转化前后BbJEN1的表达情况。RT-PCR检测结果显示,球孢白僵菌转化子BbJEN1基因的表达水平显著下降,表明干扰载体具有明显的沉默效应。在两种培养基上,转化子与原始菌株的生长速度和产孢量差异均不显著,而分生孢子萌发则显著滞后于原始菌株。使用马尾松毛虫幼虫对转化子和原始菌株进行生物测定,原始菌株的半致死浓度、半致死剂量和半致死时间分别为2.79×106个孢子/mL、84.12个孢子/mm2和6.49d,而转化子的半致死浓度、半致死剂量和半致死时间则分别增加到1.27×107个孢子/mL、382.92个孢子/mm2和8.09d,毒力显著下降。由此表明BbJEN1基因与球孢白僵菌分生孢子发芽以及毒力均有关。

低亲和力钠依赖二羧基转运蛋白随增龄表达变化的研究

目的 研究大鼠及人类肾脏低亲和力钠依赖(Na^+/)二羧基转运蛋白(NaDC1)随增龄的表达变化规律并探讨其在肾脏衰老变化中的意义。方法 采用Northern杂交、Western印迹及免疫组化等方法对大鼠出生后1d、7d、1个月、3个月、12个月、24个月及少年、中青年、老年正常人肾脏 NaDC1的表达变化。结果 大鼠NaDC1 mRNA表达呈现随肾组织发育成熟表达逐渐增强,1个月达高峰,后随增龄表达下降的趋势(P<0.05)。Western印迹显示NaDC1蛋白随鼠龄增高表达逐渐增强,3个月达高峰,后表达渐降的趋势。免疫组化结果显示大鼠及人类肾组织NaDC1分别表达于近端小管刷状缘,大鼠生后1d表达最弱,后表达渐强,到3个月达高峰(5.30±1.52比1.40±0.43,P<0.01),后呈现渐降的趋势(P<0.05)。人类肾组织NaDC1表达呈现随增龄渐降的趋势。结论 大鼠及人肾组织进入衰老时,NaDC1 mRNA及蛋白表达均呈现下降的趋势,可作为对肾脏衰老观察的指标之一。