人羧肽酶A1活性中心的毕赤酵母可溶表达

目的:应用毕赤酵母表达系统表达人羧肽酶A1(carboxypeptidaseA1,CPA1)活性中心蛋白.方法:从pGEX-CPA1重组质粒中扩增出CPA1活性中心基因,亚克隆入酵母表达载体pPIC9K,酵母重组表达载体pPIC9K-CPA1activecen-ter电转化入毕赤酵母SMD1168,并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选,对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达.结果:构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9K-CPA1activecen-ter,经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体的重组酵母表达菌株,诱导表达后得到CPA1活性中心蛋白.结论:在毕赤酵母中成功表达了CPA1活性中心,为进一步研究CPA1活性中心在抗体导向酶-前体药物疗法中的应用打下了基础.

基因芯片法检测胆囊胆固醇结石病人肝脏羧肽酶E的表达

目的:利用基因芯片和实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)分析胆囊胆固醇结石病人肝脏中羧肽酶E(carboxypeptidase E,CPE)的mRNA表达,探讨CPE与胆囊胆固醇结石形成可能相关的分子机制。方法:检测病人的血清总胆固醇、三酰甘油以及胆石、胆汁成分测定。正常肝细胞株(HL-7702)为共同参照,用含10 000个cDNA克隆的芯片对8份肝脏标本样品(包括6例胆囊结石和2例无胆囊结石对照)进行基因表达谱对比分析;通过实时PCR验证阳性结果。结果:有效表达基因6 068个,与正常对照组比较,胆固醇结石病人的肝脏有67条差异表达基因,其中CPE基因呈下调表达,经实时PCR验证与芯片筛选结果一致。进一步比较另12例胆固醇结石病人和8例对照组的肝脏组织CPE表达,CPE在胆囊胆固醇结石病人肝脏中的表达也显著低于对照组(39.52±6.21比124.50±36.36,P<0.05)。结论:肝脏CPE表达下降可能与胆囊胆固醇结石的形成有关。

γ-sem inoprotein单链抗体/突变型人羧肽酶A融合基因的构建

目的 从人正常肺组织中提取羧肽酶 A基因后进行了定点突变 ,并将突变型人羧肽酶 A基因与抗精浆蛋白单链抗体基因进行融合 .方法 应用重叠延伸法将突变型人羧肽酶 A与抗精浆蛋白单链抗体基因进行融合 ,并在大肠杆菌中进行表达 .结果 序列分析表明 :我们得到大约为 1 980 bp的基因 ,其 5 端为抗精浆蛋白单链抗体基因 ,3 端为人羧肽酶 A突变体基因 ,抗精浆蛋白单链抗体和突变型人羧肽酶 A基因成功地融合为一条基因 ,应用 p GEX- 4 T- 1表达载体原核表达得到一 Mr约为 970 0 0的特异蛋白 .结论 抗精浆蛋白单链抗体和突变型人羧肽酶

急性肺栓塞后肺泡巨噬细胞Latexin表达上调及其对炎症的影响

目的:研究大鼠急性肺栓塞模型肺组织中羧肽酶抑制剂Latexin的表达变化及其对肺部炎症的影响。方法:建立大鼠急性肺栓塞模型,分别在急性肺栓塞后1、8、24和48 h开胸取出肺组织。常规提取肺组织的总RNA和总蛋白,以正常组为对照,采取半定量RT-PCR的方法研究Latexin在mRNA水平表达的变化;采用Western-blot方法进一步验证Latexin在蛋白水平表达的变化;采用免疫组织化学的方法检测大鼠肺组织中Latexin在肺栓塞前后表达的变化及其组织分布情况。分别在大鼠急性肺栓塞后1、8、24和48 h暴露气管,进行支气管肺泡灌洗,支气管肺泡灌洗液(BALF)上清采用放射免疫法(RIA)检测内皮素-1(ET-1)的浓度;采用ELISA法检测白三烯C4(LTC4)的浓度;细胞沉淀用于分离正常大鼠肺泡巨噬细胞(AMs),并进一步用免疫磁珠法纯化AMs。采用半定量RT-PCR和Western blot法检测AMs在急性肺栓塞后不同时间点Latexin及其作用底物羧肽酶A3(CPA3)的表达。结果:在大鼠急性肺栓塞后8h,肺组织内Latexin的mRNA水平和蛋白水平均逐渐升高。免疫组化研究表明急性肺栓塞后AMs在肺泡腔内的浸润增加,Latexin主要表达于AMs。急性肺栓塞大鼠BALF中分离的AMs无论Latexin和CPA3的表达都明显升高。随着Latexin表达的升高,ET-1和LTC4的浓度也随之升高。结论:急性肺栓塞后AMs中Latexin及其作用靶蛋白CPA3的表达均升高,二者处于一种动态的平衡。大鼠急性肺栓塞后AMs中Latexin的表达显著升高,抑制了CPA3的酶解作用,使得ET-1和LTC4的浓度增加,从而促进了肺部炎症的发展和肺血管收缩。