人羧肽酶A1活性中心基因的克隆及原核表达

目的 :克隆人羧肽酶A1 (carboxypeptidaseA1 ,CPA1 )活性中心基因 ,构建重组表达载体并对其进行诱导表达 .方法 :通过RT PCR方法扩增出正常胰腺组织中CPA1活性中心基因 ,克隆入载体 pGEM Teasy ,测序分析 .将该目的基因亚克隆于表达载体 pGEX 4T 1 ,测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α ,经IPTG诱导表达重组蛋白 .结果 :获得了人CPA1活性中心基因 ,构建了重组表达质粒 ,表达的蛋白以SDS PAGE分析 ,在Mr 约 4 6 0 0 0处出现一条新生蛋白带 ,经凝胶薄层扫描检测 ,表达量约占菌体总蛋白的 2 2 .1 % .结论 :成功克隆人CPA1活性中心基因并得到了其原核表达产物 。

羧肽酶A1及其活性中心基因的表达及活性分析

目的:克隆羧肽酶A1(carboxypeptidase A1,CPA1)全酶及其活性中心基因,构建重组表达载体进行诱导表达,分析表达产物活性。方法:RT-PCR扩增CPA1全酶及活性中心基因,测序分析后将目的基因克隆于表达载体pGEX-4T-1,测序证实插入方向正确后转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达目的基因后SDS-PAGE电泳分析。目的蛋白经变性、复性、纯化后MTT 法和集落形成试验鉴定其活性。结果:获得了人CPA1全酶及活性中心基因,目的基因诱导表达后约66 kD及46 kD处可见新生蛋白带;活性分析显示CPA1全酶和活性中心蛋白都具有一定的催化水解活性,但后者对肿瘤细胞的杀伤效果较弱。结论:能成功克隆了人CPA1全酶及其活性中心基因,获得了二者的原核表达产物,体外具有一定活性。可望以人羧肽酶A1全酶及其活性中心基因为新起点,继续完善优化羧肽酶A1系统,为抗体靶向治疗前列腺癌的临床应用奠定基础。

人羧肽酶A1的毕赤酵母可溶表达

目的应用毕赤酵母表达系统表达人羧肽酶A1(carboxypeptidase A1,CPA1)蛋白。方法从pGEX-CPA1重组质粒中扩增出CPA1基因,亚克隆入酵母表达载体pPIC9K,酵母重组表达载体pPIC9K-CPA1电转化入毕赤酵母SMD1168,并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选,对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达。结果构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9K-CPA1,经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体的重组酵母表达菌株,诱导表达后得到CPA1蛋白。结论在毕赤酵母中成功表达了CPA1,为进一步研究CPA1在抗体导向酶-前体药物疗法中的应用奠定了基础。

羧肽酶A1全酶及其活性中心基因的克隆及原核表达

通过RT-PCR方法扩增出CPA1全酶及活性中心基因,分别克隆入载体pGEM-T easy,测序分析。将两段目的基因亚克隆于表达载体pGEX-4T-1,测序证实序列插入正确后转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组蛋白。结果表明,成功克隆了人CPA1全酶及其活性中心基因并得到了原核表达产物,为进一步分析比较CPA1全酶及其活性中心的特性、了解CPA1结构与功能的关系并最终得到CPA1最小活性结构域奠定基础。

羧肽酶A1全酶及其肽段基因的克隆及分泌表达

目的:克隆人羧肽酶A1(CPA1)全酶及其4条肽段基因,构建重组表达载体,并在COS-7细胞中分泌表达.方法:以胰腺总RNA为模板,RT-PCR扩增CPA1全酶基因;再以全酶基因为模板,PCR扩增其4条肽段基因;扩增产物分别克隆于分泌表达载体pFLAG-CMV-1中构建重组载体;然后用脂质体转染COS-7细胞,分泌表达融合FLAG-tag的目的蛋白和肽段;点印迹法检测目的蛋白的表达.结果:获得了CPA1全酶及其4条肽段基因,构建了重组表达载体,测序证实插入序列正确,并在COS-7细胞中成功分泌表达了融合FLAG-tag的目的蛋白和肽段.结论:在COS-7细胞成功分泌表达了融合FLAG-tag的CPA1全酶及其4条肽段,为下一步酶活性测定奠定了基础.

羧肽酶A1与慢性胰腺炎关系的研究进展

羧肽酶A1(CPA1)是继胰蛋白酶原之后胰液的第二大主要成分,CPA1基因突变所致的消化酶错误折叠及内质网应激促进了胰腺腺泡细胞死亡,进而参与了慢性胰腺炎的发生发展过程。本文就CPA1与慢性胰腺炎关系的研究进展进行综述,以期为慢性胰腺炎的遗传致病机制及发掘慢性胰腺炎防治的潜在靶点提供新视角。

肿瘤靶向治疗活性人羧肽酶A1最适片段的分析和克隆

目的:获得肿瘤靶向治疗用活性人羧肽酶A1(hCPA1)的最适片段。方法:计算机分析hCPA1活性相关氨基酸,PCR扩增选择最适基因片段,克隆入PQE-80载体,转化Rosetta gami2(DE3)进行表达,与hCPA1活性中心片段比较酶活性。结果:PCR成功扩增了hCPA1活性中心和hCPA1活性短片段基因,酶切鉴定和测序均证实重组表达载体构建成功,表达的蛋白以SDS-PAGE分析,分别在约25×103和20×103处出现新生蛋白条带,蛋白质印迹法实验证实了新生蛋白为目的蛋白。Hippuryl-L-Phenylalanin(H-L-P)实验显示两者均具有羧肽酶活性,且hCPA1活性短片段的活性与活性中心相当。MTT和细胞凋亡实验结果表明两者均能有效地水解前体药物MTX-α-Phe,抑制前列腺癌细胞株PC-3增殖,促进PC-3细胞凋亡。结论:成功克隆和表达了人hCPA1活性短片段基因和hCPA1活性中心,获得相对分子质量小而具有相似活性的hCPA1蛋白,为进一步将其应用于前列腺癌的ADEPT导向治疗创造了条件。

羧肽酶A1全酶及其肽段的分泌表达及活性测定

抗体导向酶一前体药物疗法（antibody—directed enzyme prodrug therapy，ADEPT）自1987年由Bagshawe等提出以来，其研究受到广泛关注。目前，构建抗体一酶融合蛋白及其应用已成为研究热点。我们在用人羧肽酶A1（carboxypeptidase A1，CPA1）系统对前列腺癌ADEPT疗法的研究中发现CPA1分子量大，在临床试验研究操作中存在一定困难。我们拟通过在活性中心两侧扩展片段的方法来提高酶活性，克隆并分泌表达CPA1全酶及其包括活性中心在内的4条肽段，并对其活性进行测定。

猪胰脏羧肽酶转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性研究

羧肽酶(carboxypeptidase)是一类可水解肽链C末端氨基酸残基的蛋白酶,可用作饲料添加剂,促进畜禽生长。猪胰脏中含有一种羧肽酶A1(CPA1),该酶除能水解蛋白质外,还能分解油脂。CPA1在以酪蛋白和橄榄油为底物时,比活力分别为53.14 U/mg和22.4 U/mg;经过p H2.0酸性环境和胰蛋白酶处理后,其酶活残留率分别为95.65%和78.14%。结果表明,CPA1具有转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性。

免疫组化抗体CPA1对胰腺腺泡细胞癌的诊断具有高敏感性和特异性

胰腺腺泡细胞癌是一类源自胰腺腺泡细胞的罕见类型癌,常混合其他类型癌成分,其预后优于导管细胞癌,但比神经内分泌肿瘤差;其组织形态、免疫组化与神经内分泌肿瘤常交叉,难以鉴别。羧肽酶A1(CPA1)是一种由胰腺腺泡细胞产生,并在膳食蛋白中切割C末端支链和芳香族氨基酸中发挥作用的锌金属蛋白酶,由位于7q32.2的CPA1基因编码。近年,研究发现CPA1在胰腺腺泡细胞癌中具有高敏感性和特异性。

胰腺癌患者的血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9表达及其临床意义

目的探究胰腺癌患者血清外泌体Ephrin A型受体2(Exo-EphA2)、羧肽酶A1(CPA1)和CA19-9的表达水平及其在胰腺癌诊断中的应用价值。方法选择2018年1月至2020年1月吉首大学第一附属医院收治的82例胰腺癌患者作为研究对象,并选择同期该院的60名健康体检者设为对照组,收集所有入组者的临床资料。采用ELISA法检测血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9的表达水平,并分析其与患者临床病理特征的关系。采用Pearson相关系数法分析血清ExoEphA2、CPA1和CA19-9表达水平的相关性。采用单因素和多因素logistic回归法分析胰腺癌发生的危险因素。采用ROC曲线评估血清Exo-EphA2、CPA1、CA19-9单独及联合检测诊断胰腺癌的效能。结果与对照组相比,胰腺癌组血清ExoEphA2、CPA1和CA19-9的表达水平均较高,组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。低分化、Ⅲ~Ⅳ期和有远处转移的胰腺癌患者的血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9表达水平分别高于高/中分化、Ⅰ~Ⅱ期和无远处转移者,组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,血清Exo-EphA2表达水平与血清CPA1、CA19-9表达水平均呈显著正相关(r=0.572,P=0.000;r=0.610,P=0.000),血清CPA1表达水平与血清CA19-9表达水平呈显著正相关(r=0.503,P=0.000)。血清Exo-EphA2高表达、CPA1高表达、CA19-9高表达及糖尿病史是胰腺癌发生的独立危险因素。血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9单独及联合检测诊断胰腺癌的AUC分别为0.756(95%CI:0.721~0.836)、0.752(95%CI:0.714~0.811)、0.682(95%CI:0.634~0.732)和0.862(95%CI:0.822~0.889),联合检测的诊断效能显著高于单独检测(P均<0.05)。结论胰腺癌患者的血清Exo-EphA2、CPA1和CA19-9表达水平较高,联合检测具有较高的胰腺癌诊断价值。