重组大肠杆菌S3-2产羰基还原酶发酵工艺优化及动力学研究

以重组大肠杆菌S3-2为发酵菌株,通过单因素实验和正交实验对重组大肠杆菌S3-2产羰基还原酶的1 L发酵罐发酵工艺进行优化,并通过Logistic方程和Luedeking-Piret方程对重组大肠杆菌S3-2分批发酵产羰基还原酶的动力学过程进行模拟。结果表明,重组大肠杆菌S3-2的最佳发酵工艺为:IPTG在OD600值为1.0时诱导、IPTG终浓度为0.30 mmol·L^(-1)、种子液OD600值为3.0时接种、诱导温度为26℃,在此条件下,菌体细胞干重为1.586 g·L^(-1)、羰基还原酶酶活为0.712 U·mL^(-1);菌体生长、羰基还原酶酶活及甘油消耗的动力学模型的拟合度分别为0.9883、0.9917和0.9807,说明该模型对重组大肠杆菌S3-2的发酵动力学模型拟合良好,为后续中试放大研究提供了理论依据。

分子改造羰基还原酶CpCR提高其催化合成2-苯乙醇能力

该研究对近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶CpCR进行分子改造,以提高其催化合成2-苯乙醇的能力。通过易错PCR构建突变文库,利用2,4-二硝基苯肼高通量筛选阳性突变株,测序确定氨基酸突变位点。再通过蛋白质半理性设计进行虚拟饱和突变,采用定点突变技术进行构建和评价。筛选获得突变体T171F具有更强的催化能力和热稳定性。进一步考察了催化时间、温度、pH值和底物浓度对wtCpCR和T171F催化合成2-苯乙醇的影响。研究表明,酶最适催化合成2-苯乙醇的温度为30℃;T171F最适催化合成2-苯乙醇的pH为6.5;苯乙醛的质量浓度为1000 mg/L时T171F产率可达91.24%,是wtCpCR的2.8倍。此外,突变体T171F相比wtCpCR催化时间由10 h降低到4 h,催化效率得到很大的提高。该研究为羰基还原酶催化合成2-苯乙醇提供科学基础,同时具有一定的应用价值。

双羰基还原酶催化的两步羰基还原反应(英文)

双羰基还原酶(diketoreductase)选择性催化β,δ-二羰基酯底物还原生成相应的双羟基产物,其对映体过量(ee)和非对映体过量(de)均大于99.5%。为阐明该独特酶促反应的催化机制,研究了双羰基还原酶催化的双羰基反应过程及其反应特征。通过反应历程监测发现在双羰基还原及其逆反应过程中均生成两个单羟基中间产物。这两种单羟基中间产物经反相C18色谱法分离纯化,并采用手性分析鉴定了其立体化学特征。两个中间产物可以作为双羰基还原酶的底物被选择性还原,但具有不同的反应速率。反应温度和底物浓度对中间体的形成和消失有较大的影响。此外,初级稳态动力学显示两个中间产物的消除反应速率也不尽相同。结果表明,双羰基还原酶催化的双羰基还原是一个伴有中间产物的生成与消失的两步反应过程,并且反应速率有所不同。

响应面-满意度函数优化产羰基还原酶工程菌发酵条件

以实验室构建的产羰基还原酶的重组大肠杆菌为出发菌株,以菌体生长(A600nm)和羰基还原酶比活为响应值,对重组大肠杆菌产羰基还原酶的发酵条件进行优化。首先采用Plackett-Burman设计筛选出了4个关键影响因子:蛋白胨、酵母粉、磷酸盐和甘油;随后以Box-Behnken中心组合设计分别建立上述4个影响因子对A600nm和羰基还原酶比活的数学模型;最后通过满意度函数获得最佳发酵条件为:蛋白胨15.99 g/L,酵母粉31.06 g/L,磷酸盐105.37 mmol/L,甘油4.66 m L/L,Na Cl 0.4g/L,Mg SO40.2 g/L,接种量1%以及诱导时间8 h。在此优化条件下,重组大肠杆菌产羰基还原酶和菌体生长能力得到了较大的提升,羰基还原酶比活由优化前的1.031 U/mg提高到了1.706 U/mg,提高了65%。

近平滑假丝酵母(R)-专一性羰基还原酶基因的克隆与表达

根据纯化得到的(R)-专一性羰基还原酶(rCR)蛋白质测序结果推导出的核苷酸序列设计引物,以筛选得到的近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011基因组为模板,通过PCR扩增目的片段,克隆后测序。核苷酸序列测定结果表明rcr基因全长1011bp,共编码336个氨基酸,分子量为35·9kD。将序列递交NCBI比对,与醇脱氢酶超家族成员序列同源性达99%。在大肠杆菌(Escherichia coli)JM109中表达rcr基因,重组菌可还原β-羟基苯乙酮得到(R)-苯乙二醇,光学纯度为100%e·e,摩尔产率为80·4%,在反应体系中无需外加辅酶再生系统即可完成转化。

一种新的高立体选择性羰基还原酶的性质及分离

从近平滑假丝酵母(CandidaparapsilosisCCTCC203011)中分离得到了新的NADPH依赖型羰基还原酶。粗酶经硫铵分级沉淀、DEAESepharose离子交换层析、Phenyl-sepharoseFF疏水层析、BlueSepharoseFF亲和层析后在SDS-PAGE上显示为单一条带,其酶蛋白的相对分子质量为30kD。该酶还原反应的最适pH值为4.5,最适温度为35℃,Cu2+对羰基还原酶有强烈的抑制作用。该酶具有较高的底物专一性和立体选择性,对α-羟基苯乙酮和4-氯乙酰乙酸乙酯具有较高的不对称还原活力,其产物分别为(S)-苯基乙二醇和(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯,e.e值分别为100%和94.3%。因此该酶蛋白是不对称合成手性醇有效的生物催化剂之一。经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中一个肽段的氨基酸序列,通过比对发现该酶与假定蛋白(hypotheticalproteinCaO19.10414)具有一定的同源性。

(R)-专一性羰基还原酶与甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的共表达

【目的】通过研究(R)-专一性羰基还原酶和甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的共表达,解决较高底物浓度下不对称转化反应的辅酶限制性问题。【方法】分别以近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)基因组为模板,采用PCR方法扩增得到(R)-专一性羰基还原酶基因(rcr)和甲酸脱氢酶基因(fdh),克隆到共表达载体pETDuet^(TM)-1中进行表达。共表达质粒pETDuet-rcr-fdh转化稀有密码子优化型菌株E.coli Rosetta,获得重组菌E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh。【结果】在30℃条件下,经1 mmol/L IPTG诱导表达8 h后,SDS-PAGE结果表明(R)-专一性羰基还原酶和甲酸脱氢酶均有明显的表达,其相对分子质量分别为37 kDa和40 kDa。以高浓度(6 g/L)2-羟基苯乙酮为底物时,0.1 g重组菌细胞催化产生(R)-苯基乙二醇,产物光学纯度为100%e.e.,产率为85.9%。与无甲酸脱氢酶参与辅酶再生循环的重组菌E.coli Rosetta/pETDuet-rcr相比,产物光学纯度和产率分别提高了1.3和2.7倍。【讨论】该重组菌的构建为基因工程法生物合成(R)-苯基乙二醇的工业应用奠定了基础。

解脂酵母羰基还原酶基因的克隆表达及酶学性质

通过构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-yacrⅡ,成功实现了解脂酵母(Yarrowia lipolytica)的羰基还原酶(YaCRⅡ)基因(yacrⅡ)的表达.应用HisTrap HP亲和层析分离纯化YaCRⅡ,并对该酶的酶学性质进行了研究.结果表明,yacrⅡ基因序列长942bp,编码蛋白的分子质量为37ku,属于中链醇脱氢酶家族.该酶可以催化不对称还原2-羟基苯乙酮生成(S)-1-苯基-1,2-乙二醇,酶的比活力为7.85U/mg,光学纯度为99.9%(e.e.).该酶反应的最适pH值为5.0,最适温度为50℃.底物结构分析表明,该酶对苯环对位有吸电子基团的2-羟基苯乙酮有较高的催化活性.该酶的发现为制备高光学纯度的手性醇提供了一个新的有效方法.

羰基还原酶工程菌构建及其应用于还原制备S-CHBE

S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)是多种药物的手性中间体,可由4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)不对称还原合成。该研究对来自Candida magnoliae AKU4643的S1羰基还原酶基因进行E.coli密码子优化,获得的S1'基因序列并进行人工合成,利用该序列构建了基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-S1',提高了羰基还原酶表达效率,经诱导条件优化后羰基还原酶活力达11.49 U/mg蛋白;将BL21(DE3)/pET28a-S1'与E.coli BL21(DE3)/pET28a-gdh进行偶联,在单一水相中未添加辅酶条件下转化10 h,产物的摩尔转化率和对映体过量值(e.e.)分别达92.1%和100%。

重组大肠杆菌BL21-pET28a(+)-ADH诱导表达羰基还原酶的条件优化与应用

目的:对重组大肠杆菌E.coli BL21-pET28a(+)-ADH表达羰基还原酶的条件进行优化,以增加目的蛋白的表达量,提高生物合成(S)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的转化率。方法:将重组质粒pET28a(+)-ADH转化E.coli BL21后,对诱导过程产生影响的4个因素,诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度及摇菌转数,利用SPSS统计学软件进行正交实验设计,并对实验结果进行直观分析及方差分析,对实验得出的最佳搭配诱导条件进行验证。结果:直观分析中诱导温度的R值最大,其次为摇菌转数和诱导剂IPTG浓度,诱导时间的R值最小;方差分析表明诱导温度的P值小于0.05,而摇菌转数、IPTG浓度及时间因素的P值均大于0.05。利用优化后的菌种生物合成(S)-3,5-双三氟甲基苯乙醇,转化率达到95.16%。结论:本实验的最优诱导条件为,诱导温度25℃、诱导摇菌转数200r.min-1、诱导剂IPTG浓度0.5mmol.L-1、诱导时间6h。且重组菌对于(S)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的转化率达到95.16%。

4-氯乙酰乙酸乙酯羰基还原酶产生菌的筛选及产酶条件研究

从实验室保藏的菌株中,筛选到一株立体选择性较高的产4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)羰基还原酶的菌株———出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)SW0202,菌体产酶条件研究表明,最佳的发酵培养基配方为:麦芽糖30.0g/L,酵母膏20.0g/L,蛋白胨3.0g/L,(NH4)2SO45.0g/L,KH2PO42.0g/L,MgSO4.7H2O0.7g/L,最适发酵温度及初始pH分别为:28°C和pH6.0。该菌在此条件下发酵培养24h,产菌丝体生物量16.78g干菌体/L,COBE羰基还原酶酶活力达到1007U/L。在COBE的转化反应中,产物S-CHBE的浓度达到10.12g/L,光学纯度>97%e.e.。

类球红杆菌羰基还原酶不对称催化还原性能与底物结构的关系

将类球红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)全细胞及其分离得到的羰基还原酶用于不对称催化还原多种潜手性酮类化合物,通过比较产物的收率、ee值、酶活力以及酶学动力学常数Km,探讨了类球红杆菌的催化还原性质与底物结构的关系.结果表明,对于类球红杆菌全细胞不对称催化还原苯乙酮衍生物,产物ee值的变化遵循Prelg规则,产物收率与底物苯环及侧链上取代基团的性质有关;对于脂肪酮催化还原,产物收率随底物链长的增加和分子量的增大而降低,随支链数目的增加而升高,产物ee值的变化也遵循Prelg规则.利用羰基还原酶不对称催化还原潜手性酮类化合物发现,对于芳香酮类化合物,酶对α位为强电负性基团的底物专一性较强;对于脂肪酮类化合物,酶对五碳脂肪酮的专一性较高.利用酶直接催化还原反应产物的ee值均为99%左右,表明酶较全细胞有更高的立体选择性.

厄斯考维菌产羰基还原酶的发酵条件优化

从土壤中筛到一株产羰基还原酶的菌种骚动厄斯考维菌(Oerskovia turbata)ZJPH1604,利用该微生物细胞可不对称催化3-氯苯乙酮合成(R)-1-(3-氯苯基)乙醇,对映体过量值>99.9%.通过单因素试验发现:酵母提取物、(NH_4)_2SO_4和KH_2PO_4为影响酶活的显著影响因子,继而采用响应面法对产酶条件进行了优化.结果表明:最优发酵培养基组成为葡萄糖15.0g/L,酵母提取物30.0g/L,(NH_4)_2SO_4 2.6g/L,KH_2PO_4 2.8g/L,NaCl 0.6g/L,MgSO_4 0.8g/L.在最适培养条件下,菌体羰基还原酶的酶活力达到32.0U/g,较优化前提高了166.7%.为高效合成(R)-1-(3-氯苯基)乙醇提供了新途径,丰富了生物不对称合成手性药物中间体的手段.

羰基还原酶1和热休克蛋白27可能是肝癌早期标志物

目的:以小肝癌为研究对象筛查早期肝癌的潜在标志物。方法:从10例乙肝相关小肝癌病人的癌组织和癌旁相对正常组织中提取蛋白质,采用双向凝胶电泳将蛋白质充分分离。胶图分析后,对肝癌相关蛋白质采用MALD I-TOF/TOF质谱仪鉴定。最后采用实时聚合酶链反应(Real-time PCR)和免疫印迹(W esternblotting)方法来评估羰基还原酶1(CBR1)、热休克蛋白27(HSP27)在肝组织中的表达。结果:在肝癌组织中发现了15个上调和3个下调蛋白。氧化还原酶和5种代谢相关酶中的3种在癌组织中升高,2种代谢相关酶在癌组织中降低。Real-time PCR和W estern blotting证实了10例小肝癌中CBR1和HSP27的高表达。结论:CBR1和HSP27可能是早期肝癌的诊断标志物。

近平滑假丝酵母ATCC 7330中羰基还原酶双水相萃取工艺研究

研究了聚乙二醇(PEG)/硫酸铵[(NH4)2SO4]双水相体系萃取近平滑假丝酵母ATCC 7330粗酶液中羰基还原酶的工艺,考察了无机盐种类、PEG分子量及其质量分数、(NH4)2SO4质量分数、萃取温度、萃取时间等因素对羰基还原酶纯化倍数的影响。确定最优的双水相萃取条件为:(NH4)2SO4质量分数15%、PEG1000质量分数19%、萃取温度16℃、萃取时间15 min,在此条件下,羰基还原酶的纯化倍数可达6倍。为近平滑假丝酵母ATCC 7330中羰基还原酶在手性化合物的绿色合成中的应用奠定了基础。

E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-cr羰基还原酶分离纯化及酶学性质研究

利用强酸型阳离子交换层析和疏水作用层析技术,从实验室构建的羰基还原酶工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a(+)-cr细胞中分离得到电泳纯NADP(H)依赖型的羰基还原酶,LC-MS-QTOF分析揭示其相对分子质量为35.4 k Da。该酶能不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(CHOHB)、4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)合成阿托伐他汀关键手性合成子6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯、(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯,对丙酮酸乙酯、丁二酮也表现出较高的还原能力。该羰基还原酶的最适作用条件为:30℃,p H7.5;且活性不依赖于金属离子。它催化CHOHB还原反应的最大反应速度vmax 54.3μmol·mg-1·min-1,KmCHOHB值4.4 mmol·L-1;作用于COBE时,最大反应速度vmax 36.5μmol·mg-1·min-1,KmCOBE值1.2×10-1 mmol·L-1。E.coli BL21(DE3)/p ET28a(+)-cr羰基还原酶在他汀手性侧链制造上具有广阔的应用前景。

恶臭假单胞菌产羰基还原酶的发酵条件优化

从土样中筛选得到一株产羰基还原酶的菌种恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZJPH1606,该菌能不对称催化2'-三氟甲基苯乙酮合成(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇,对映体过量值超过99.0%.通过单因素考察产酶培养基组成发现:葡萄糖、牛肉膏和MgSO_4·7H_2O对酶活的影响较为明显,进一步采用响应面法对产酶培养基进行了优化.结果表明:最优发酵培养基组成为葡萄糖38.5g/L,牛肉膏32.7 g/L,MgSO_4·7H_2O 1.1 g/L.在最适培养条件下,菌体酶活力达0.31 U/g,较优化前提高了71.0%.该研究结果丰富了羰基还原酶数据库的基因序列,为高效合成(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇提供了新途径.

响应面法优化高选择性羰基还原酶产生菌Saccharomyces cerevisiae B5的培养基组成

借助于SAS软件,采用部分因子实验设计(FFD)和响应面分析法(RSM),对能够产生高选择性羰基还原酶的菌株Saccharomyces cerevisiae B5进行发酵培养基的优化.部分因子实验设计结果表明葡萄糖、硫酸铵、硫酸镁及磷酸氢二钾为影响Saccharomyces cerevisiae B5产生高选择性羰基还原酶的四个显著性因素.通过响应面分析法,得到最优发酵培养基组成为:葡萄糖29.7 g/L,酵母粉3 g/L,硫酸铵4.784 g/L,无水硫酸镁0.267 2 g/L,K2HPO4.3H2O 1.026 g/L,KH2PO41g/L.在优化的培养基条件下,羰基还原酶活力最高可达1 498.2 U/g.

近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶CpCR突变体酶的稳定性研究

通过蛋白质理性设计和定点突变技术,在近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶wtCpCR的基础上,构建5个突变体酶A98N、S307N、G262N、S216N和S258N,考察了有机溶剂、温度、剪切力、氧气、辅酶NADPH浓度对突变体酶的稳定性影响。研究表明,A98 N在磷酸盐(potassium phosphate,PB)缓冲溶液中比酶活力提高10%,而S307 N没有酶活力,其他3个突变体比酶活力均有降低;A98 N和G262 N在PB/甲基叔丁基醚的双相体系中界面稳定性比原始酶wtCpCR分别提高1.7和1.4倍;4个突变体酶的耐热特性略有下降,T_(50)值介于31~36℃;在100、200 r/min条件下,4个突变体耐剪切力均增强,在300 r/min条件下G262 N突变酶的耐剪切稳定性比wtCpCR增强1.3倍;G262 N突变酶在有氧条件下的稳定性更好,比野生酶提高1.4倍,半衰期(t_(1/2))达到11.87 h;辅酶浓度为0~0.4 mmol/L时,G262 N突变酶更加稳定。该研究为该羰基还原酶wtCpCR的多点突变进一步改善酶稳定性提供重要的科学依据,同时可提高该酶在双相体系生物催化工艺的经济性。

热激蛋白27及羰基还原酶1与肝癌的研究进展

热激蛋白27(HSP27)是小热激蛋白亚家族中的一员,HSP27的高表达与乙型肝炎病毒(HBV)相关肝细胞癌(HCC)密切相关;且在正常肝、乙型肝炎、肝硬化、癌周肝硬化和HCC中,HSP27的表达有差异。羰基还原酶1(CBR1)属于短链脱氢还原酶家族,它在HCC中表达有差异,但在正常肝、乙型肝炎、肝硬化、癌周肝硬化中的表达目前无研究。肝癌早期发病隐匿,甲胎蛋白(AFP)作为肝癌早期诊断指标存在一定局限性。是否能将HSP27、CBR1与AFP三者联合检测HCC,提高肝癌早期诊断率或作为肝癌诊断标志物,有待进一步研究。