细菌转录翻译偶联机制研究

中心法则描述了遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的传递过程。转录过程是RNA聚合酶以DNA为模板合成信使RNA的过程,翻译过程是核糖体利用信使RNA合成蛋白质的过程。与真核生物不同,细菌和古菌没有细胞核膜的分隔,其转录过程和翻译过程在相同时间、相同位置上进行。其中,RNA聚合酶与核糖体相互协同,同步完成转录和翻译的现象被称为转录翻译偶联。转录翻译偶联是细菌和古菌的一种重要基因调控机制,能同时有效地调控转录过程和翻译过程,是细菌适应复杂环境的重要生物学基础。数十年来,大量的研究逐步揭示了细菌转录翻译偶联机制在细菌基因表达调控中的作用,一系列参与转录翻译偶联过程的调控因子也被鉴定发现。近期,基于不同偶联状态的转录翻译偶联复合体结构的突破性研究,首次系统地展示了在不同信使RNA间距下,转录翻译偶联过程的动态变化,为后续研究转录翻译偶联基因调控机制提供了理论基础。

翻译偶联对霍乱毒素A、B亚基比例表达的影响

目的：证实霍乱毒素操纵子Ａ、Ｂ基因间存在翻译偶联，解释霍乱毒素Ｂ亚基基因表达水平是Ａ 亚基５ 倍的机理。方法：构建了适合翻译调控研究的报告质粒，通过在ｃｔｘＡ 基因５′及３′端进行移码突变，研究突变对Ｂ亚基基因表达水平的影响。结果：建立了合适的研究霍乱毒素基因翻译调控的系统，在ｃｔｘＡ 基因的近Ｃ端移码突变后，Ｂ基因的表达水平降低到１／５（８０％ ）。结论：霍乱毒素Ａ、Ｂ亚基基因间存在翻译偶联调控，这种调控是霍乱毒素Ａ、Ｂ亚基比例表达的机理之一。

与剪接、翻译偶联的PTC-mRNA NMD降解机制

最新研究发现 ,真核细胞前体 m RNA剪接不仅仅是前体 m RNA的加工步骤 ,而且在翻译过程中也起到重要的监控作用。通过剪接 ,外显子 -外显子连接点复合物结合于 m RNA剪接位点上游 2 0 bp处。如果 m RNA剪接位点上游大于 5 0～ 5 5 bp处出现无义突变 ,则这种翻译提前终止密码子 m RNA将会在最后的翻译过程中通过外显子 -外显子连接点复合物、Upf蛋白以及帽结合蛋白之间的相互作用 ,被引入脱帽。

利用翻译偶联实现广谱抗病毒蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达

目的以具有广泛助溶活性的小泛素相关修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)为辅助蛋白,利用翻译偶联,构建一种新型非融合可溶原核表达载体,实现广谱抗病毒蛋白RA在大肠杆菌中的非融合可溶表达。方法以PCR方法从酵母基因组中克隆SUMO蛋白基因smt3并进行定点突变,去除其中的EcoRⅠ酶切位点,获得同义突变体m SUMO。通过翻译偶联Linker序列的设计、合成,构建以m SUMO蛋白为辅助蛋白的翻译偶联表达载体p TIG-m SUMO。PCR扩增获得带有相应酶切位点的广谱抗病毒蛋白RA的基因,将其克隆至p TIG-m SUMO中,获得表达载体p TIG-m SUMO/RA,实现RA在大肠杆菌中的非融合可溶性表达。结果 IPTG诱导蛋白表达以后,SDSPAGE和Western印迹检测证实,目的蛋白RA的表达量明显增加,且可溶比例约占50%。结论以优化后的SUMO为辅助蛋白,成功构建了一种非融合的可溶原核表达载体p TIG-m SUMO,实现了RA蛋白在大肠杆菌中的高效非融合可溶表达,既提高了表达水平,也提高了可溶性。p TIG-m SUMO作为一种可溶的非融合表达载体,在实现外源蛋白的高效可溶表达方面,很可能具有一定的普遍性。

霍乱毒素B亚基基因上游序列对B亚基表达水平的影响

本研究通过缺失突变和移码突变研究了ctxB基因上游A基因部分序列对ctxB表达水平的影响,结果表明:(1)将ctx操纵子XbaI—EcoRI片段克隆至pUC19,构建的质粒pUC19CTB中A亚基的部分序列不能翻译,该质粒转化大肠杆菌后CTB的表达产量为30μg/ml;(2)在质粒pUC19CTB的XbaI位点引入移码突变,构建质粒pMC02C,这时A亚基的部分序列的阅读框架与lacZ一致,从而A基因能够翻译至自然的终止密码,B基因的表达水平却降低一倍;(3)质粒pUC19CTB缺失XbaI～ClaI(550bp)的非翻译序列,构建质粒pMC03(A亚基序列不翻译),该质粒转化大肠杆菌后ctxB基因的表达水平降低1倍;(4)在质粒pMC03中ctxB基因上游引入移码突变,构建的质粒pMC03C(ctxB上游基因能够表达)CTB的表达水平较pMCO3低得多,较pUC19CTB低20倍以上。对产生上述现象的原因进行了分析讨论。