利用翻译延伸因子1-α启动子在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒16L1蛋白

目的利用翻译延伸因子1-α(translation elongation factor 1-α,TEF1-α)启动子在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)16 L1蛋白。方法从毕赤酵母GS115中扩增组成型TEF1-α启动子(PTEF1-α)基因,通过基因重组替换商业化表达质粒pPink-HC和pPink-LC的启动子PAOX1;在PTEF1-α下游分别克隆绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因和HPV 16 L1基因,构建重组质粒pTEF-GFP和pTEF-16 L1;将重组质粒电转化感受态毕赤酵母PichiaPink strain 1,培养不同时间后,荧光显微镜下观察GFP的表达;分别在YPD、YPG、YPM、YPSor培养基中培养pTEF-16 L1转化菌,检测菌体在不同培养基中的增殖情况;Western blot检测HPV 16 L1蛋白的表达水平。结果重组质粒pTEF-GFP和pTEF-16 L1经双酶切鉴定和序列分析表明构建正确;荧光显微镜检测显示,在不同培养时间PTEF1-α指导了GFP的成功表达,且表达量随培养时间的延长而降低;重组毕赤酵母在YPD和YPG培养基中生长迅速;4种培养基中均有HPV 16 L1蛋白的特异性表达,且在YPG和YPSor培养基中获得了HPV 16 L1蛋白较持续的表达。结论成功实现了组成型启动子PTEF1-α控制的HPV16 L1蛋白的表达,为HPV疫苗的低成本及方便生产提供了一个可供选择的有效方案。

生防长枝木霉菌培养特性及形态学与系统发育学鉴定

采用宏观观察法和显微镜镜检的方法,在PDA和MEA培养基上对1株自我采集的具有生防价值的木霉菌株T05进行了培养特性和形态学研究。结果表明：该菌株在PDA平板培养基上生长较快,产分生孢子较早且多,也能产生厚垣孢子;在MEA上能产生分生孢子,但不产生厚垣孢子。该菌株产孢簇为松散羊毛状到紧实的疱状结构;分生孢子梗具有较简单的分枝系统,通常呈直角的1～2次分枝,单生或有时成对。瓶梗不规则地在侧面分布,时常单生,安瓿形或柱形,基部常缩缢但不明显;分生孢子单细胞、长方形到椭圆形、绿色、光滑,大小为（2.0～3.0）μm×（2.0～6.0）μm。根据这些形态特征将菌株T05鉴定为长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。在此基础上,对T05的r DNA转录间区序列ITS和翻译延伸因子基因tef1-α的第5内含子序列进行了扩增、测序。系统发育学的研究表明,该菌株的ITS序列和tef1-α的第5内含子序列与长枝木霉的多个菌株都具有最大的相似性,因此属于长枝木霉。

紫云英结瘤受体激酶靶蛋白的筛选与鉴定

利用酵母双杂交技术,以结瘤受体激酶(NORK)蛋白的跨膜结构域(TM)为诱饵,进行了与其相互作用靶蛋白的筛选鉴定。结果获得41个候选阳性克隆,通过测序和在NCBI中进行Blast比对分析,发现其中一个具有重要生物学功能的互作蛋白翻译延伸因子AsEF1-α,并将该蛋白相应的编码基因命名为AsEF1-α。进一步的验证表明靶蛋白AsEF1-α与诱饵互作的关键结构域是EF1-α-Ⅲ。