肺腺癌A_(549)细胞膜上磷脂翻转酶的存在与顺铂耐药性

为证实肺腺癌细胞膜上是否存在磷脂翻转酶,将含有NBD-PE荧光探剂的脂质体与A_(549)和A_(549)/DDP细胞融合,根据外膜NBD-PE的荧光强度变化来检测细胞膜上磷脂翻转酶的存在及其活性.当含有NBD-PE的A_(549)和A_(549)/DDP细胞在保温0,30,60和90 min时,测定外膜NBD-PE的结果表明,A_(549)细胞的NBD-PE荧光强度在上述不同时间保温后分别为0％,1.4％,2.9％和7.8％;而A_(549)/DDP细胞则相应为0％,10.5％,15.5％和18.3％,证实A_(549)肺腺癌细胞膜上存在磷脂翻转酶.而且,具有抗药性的A_(549)/DDP细胞膜上的磷脂翻转酶的活力明显高于药物敏感的A_(549)细胞.用多药耐药逆转剂Verapamil(20μmol/L)在37℃处理A_(549)/DDP细胞60 min后测定其结果又表明,NBD-PE在膜外侧的增加较对照降低了25.0％.而用治疗肺腺癌的特异性抗癌药cisplatin(25μmol/L)处理时,NBD-PE在膜外侧的增加降低了31.6％,且随cisplatin的浓度增加进一步降低达79.4％.这与肺腺癌细胞的耐药性可能相关.

糖基翻转酶gtcA基因缺失降低单增李斯特菌1/2a血清型菌株致病性的研究

【目的】构建糖基翻转酶gtcA基因缺失株,并阐明其对单增李斯特致病性的影响。【方法】利用同源重组技术构建gtcA基因缺失株;进一步分析亲本株EGDe-prfA*、缺失株ΔgtcA和回补株CΔgtcA的生长能力;通过Western blotting分析gtcA基因缺失对InlA和InlB在细菌表面锚定的影响;通过DF1细胞黏附侵袭试验、RAW264.7细胞吞噬增殖试验和鸡胚毒力试验评估gtcA基因缺失对单增李斯特菌细胞侵染能力及对鸡胚致病性的影响。【结果】生长曲线显示,gtcA基因缺失并不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力。Western blotting结果显示,内化素InlB在ΔgtcA表面的锚定量极显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA(P<0.01),但其表面InlA的锚定量与EGDe-prfA*并无显著差异(P>0.05)。细胞黏附侵袭试验结果显示,ΔgtcA对成纤维细胞DF1的平均黏附率和侵袭率显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA(P<0.05)。吞噬试验结果显示,巨噬细胞RAW264.7对ΔgtcA的平均吞噬率显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA(P<0.05),但ΔgtcA与EGDe-prfA*、CΔgtcA在RAW264.7中的3 h内增殖倍数并无显著差异(P>0.05)。鸡胚毒力试验结果显示,ΔgtcA感染鸡胚肝脏和脾脏中的平均细菌载量分别为6.86×10^(3)和3.69×10^(2) CFU,极显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA感染鸡胚(P<0.01);同时,ΔgtcA感染鸡胚存活率及存活时间均高于EGDe-prfA*和CΔgtcA感染鸡胚。【结论】糖基转移酶gtcA基因缺失不影响单增李斯特菌1/2a血清型菌株EGDe-prfA*的生长能力,但能显著降低该菌表面InlB的锚定丰度,减弱该菌的细胞侵染能力及对鸡胚的致病性。本研究结果为深入探索糖基翻转酶基因gtcA介导单增李斯特菌致病机制提供参考。

里氏木霉翻转酶DRS2对木质纤维素降解酶基因表达及分泌的影响

【目的】本研究以工业生产菌株里氏木霉为研究对象,鉴定翻转酶基因drs2对其纤维素酶表达及分泌的影响。【方法】首先通过BLAST序列比对,从里氏木霉中鉴定出翻转酶基因drs2,并通过同源重组的方法在里氏木霉中构建了drs2基因的敲除菌株Δdrs2。对Δdrs2菌株及其对照株在不同碳源上的生长发育、蛋白分泌、纤维素酶及半纤维素酶的表达水平等进行比较分析,并对DSR2蛋白进行了亚细胞定位。【结果】与对照菌株Cpyr4相比,Δdrs2菌株在葡萄糖、乳糖、微晶纤维素(avicel)等条件下生长速率都明显降低。Δdrs2菌株在纤维素诱导条件下的总蛋白分泌量、纤维素酶活力、半纤维素酶活力均显著提高,但drs2基因的缺失并不影响关键纤维素酶基因的转录水平。DRS2蛋白位于里氏木霉菌丝近顶端的顶体位置。【结论】在纤维素为唯一碳源的条件下,drs2基因的缺失导致纤维素酶的产量显著提高,drs2基因不调控纤维素酶基因的转录,而是在其分泌过程中发挥作用。

香蕉枯萎病菌‘热带4号’小种翻转酶家族的生物信息学分析

由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc)引起的香蕉枯萎病威胁着中国的香蕉产业,其中‘热带4号’生理小种(Foc tropical race 4, FocTR4)危害最大。胞外水解酶与效应蛋白是Foc重要的致病因子,它的分泌与膜运输系统密切相关,而翻转酶通过调控膜上的磷脂平衡来参与膜运输系统的调控。本研究以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)翻转酶家族氨基酸序列为材料,比对鉴定到FocTR4的翻转酶家族,对其进行生物信息学分析。结果表明:(1)通过蛋白进化树分析发现FocTR4具有5个翻转酶成员,分别位于4个亚组内,其中C亚组具有2个同源翻转酶。(2) FocTR4翻转酶家族C端磷脂转移酶功能域均为疏水性的,且相对保守。(3) FocTR4翻转酶家族除质膜定位以外,FocTR4DnfA与FocTR4DnfB还会定位于内质网,FocTR4DnfD还会定位于高尔基体。(4)在FocTR4和Foc1 (Foc race 1)翻转酶家族中,2个C亚组成员功能域区域发生了变异。本研究为进一步研究FocTR4翻转酶的生物学功能提供了科学依据,也为其它真菌翻转酶的研究提供了参考。

表达翻转重组酶的真核载体的构建

目的构建表达翻转重组酶（FLP）重组表达的真核载体。方法以质粒pFRT为模板，用聚合酶链反应（PCR）扩增出两端包含了Xbal和BamHI内切酶识别位点的全长FLP基因片段，将该片段插入用NheI和BamHI双酶切后的载体质粒pBK—CMV上，构建出重组质粒pBK—CMV—FLP。经过转化、挑选菌落，PCR鉴定且测序均正确。结果成功构建重组质粒pBK—CMV—FLP。结论构建好的pBK—CMV—FLP质粒为生物工程上删除筛选标记物提供了良好的条件。

真菌中的脂质不对称调节和P4型ATP酶

脂质组分在双分子膜中不对称分布是广泛存在于真核细胞中的现象,有助于膜系统的出芽和融合,从而促进胞吞胞吐、蛋白分选运输等生理过程。多种蛋白参与维持脂质不对称,其中P4型ATP酶是重要的脂质转运体。P4型ATP酶又称脂质翻转酶,主要介导氨基磷脂的转位。在酿酒酵母、新生隐球菌、白念珠菌和构巢曲霉中,多种P4型ATP酶亚基的缺失导致蛋白运输失常,对唑类药物的敏感性升高,细胞壁完整性受损,毒力减低,在巨噬细胞中生存能力减弱等表型,提示脂质翻转酶的重要性及其作为抗真菌靶点的潜力。

P4-ATPase的生物学功能及其与疾病的关系

生物膜磷脂的不对称分布对于保证细胞代谢功能的正常进行至关重要,而其不对称性的产生和维持受P4型ATP酶(P4-ATPase)的调控。P4-ATPase是一类主动转运生物膜磷脂的蛋白,也被称为磷脂翻转酶,可以调控磷脂从细胞膜外侧或细胞器管腔面翻转到胞质面。P4-ATPase与很多生物学功能密切相关,包括囊泡运输,细胞凋亡,红细胞成熟和血液凝固等。近期研究证实P4-ATPase突变或表达异常与很多疾病的发生有关,如智力障碍、阿尔茨海默病、胆汁淤积症等。深入研究P4-ATPase的生物学功能及其与疾病的关系,有助于揭示人类相关疾病的潜在治疗靶点。