老黄酶和甲酸脱氢酶催化柠檬醛不对称还原生成香茅醛的条件优化

源自酿酒酵母的老黄酶基因oye2和源自假丝酵母的甲酸脱氢酶基因fdhcb分别成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中过量表达。重组表达的老黄酶OYE2和甲酸脱氢酶FDHCB经NiNTA亲和层析获得相应的纯酶。以这两种纯酶构建不对称还原柠檬醛生成香茅醛的催化体系,并优化了其反应条件。优化后的反应体系含有25 mmol/L柠檬醛,100 mmol/L甲酸钠,0.42mg/m L老黄酶OYE2,0.2 U/m L甲酸脱氢酶FDHCB,0.5 mmol/L NAD^+以及50 mmol/L PIPES缓冲液(pH 7.0)。在pH 7.0和30℃下反应10 h,香茅醛得率达92.0%,与没有甲酸脱氢酶辅助辅酶循环时的得率(9.8%)相比,香茅醛得率提高了约9.4倍。

氧化葡萄糖酸杆菌老黄酶Go的酶学性质鉴定

从氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)H24中克隆出老黄酶Go的基因,通过构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达可溶性的蛋白,使用离子交换柱(Hi Trap DEAE FF)对重组酶进行纯化,并对其酶学性质进行表征。结果表明:老黄酶Go的温度和p H耐受性都较好,在40℃条件下,12 h后能保持40%的活性;在p H10的条件下,12 h后能保持40%的活性;Go的底物谱十分广泛,对酰亚胺类、α,β-不饱和醛酮、萜类都有一定的活性。老黄酶Go有良好的有机溶剂耐受性,在体积分数20%的乙酸丁酯中可以保持90%左右的活性,但是金属离子对其影响较大,除Mg^(2+)和K^+外,所选的其他离子对Go都有着不同程度的抑制作用。最后,在催化性质的实验中发现,Go对柠檬醛的转化率有60%,并且其对映体过量值(e.e.)可以达到99%。

多酶一步纯化共固定系统的构建及催化不对称还原合成手性醇的研究

开发了一步纯化共固定老黄酶(OYE1)、醇脱氢酶(ADH-A)和葡萄糖脱氢酶(GDH)系统并一锅级联催化烯酮转化为手性醇类化合物,同时实现辅酶的原位再生。以镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)修饰的SiO_(2)纳米花为载体,对带有His-tag的目的蛋白ADH-A、OYE1和GDH粗酶液进行一步分离纯化及固定化,并在优化的反应条件下进行反应,对手性醇产物的产率最高可达92.37%。固定化酶相比于游离酶的稳定性更加出色。在连续5次循环使用后,固定化酶在使用时仍有较高的转化率。同时,固定化酶OYE1&ADH-A&GDH@Ni-NTA@SiO_(2)对环状、链状及芳香族烯酮类化合物均具有良好的催化性能。

假单胞菌催化的碳碳双键不对称还原

烯醇还原酶能够催化活性烯烃的不对称还原,得到具有一个或两个手性中心的烷烃化合物.为了挖掘含有烯醇还原酶的微生物资源,本研究利用柠檬醛与(Z)-乙基-3-硝基-2-苯基丙烯酸酯对土壤中的细菌进行富集筛选与鉴定,得到7株具有碳碳双键还原活力的假单胞菌.利用全细胞生物转化体系,分别研究这7株菌株对8种不同底物的转化活力,结果显示上述菌株表现出不同的底物偏好性、对映选择性以及结构选择性.例如菌株7-B-2能够以99%的转化率和e.e.值将底物(Z)-乙基-3-硝基-2-苯基丙烯酸酯转化为(S)-乙基-3-硝基-2-苯基丙酸酯;菌株9-A-1能够以75%的转化率和99%的e.e.值将底物(Z)-3-苯基-3-氰基-丙烯酸转化为(R)-3-苯基-3-氰基-丙酸.研究结果表明这7个菌株在重要手性中间体的生物合成中具有一定研究与应用价值.