洗必泰对变形链球菌、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株生长抑制的测定

目的 :通过洗必泰对变形链球菌、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株生长抑制的测定 ,探讨一种新的防龋途径。方法 :将醋酸洗必泰液稀释成不同的浓度 ,分别加入变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株菌悬液 ,测得最小抑菌浓度 (MIC)、最小杀菌浓度 (MBC)。结果 :洗必泰对变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株均有抑菌、杀菌作用 ,4种细菌最小抑菌浓度 (MIC)均值为 338μg/L ,最小杀菌浓度 (MBC)均值为 375 μg/L。结论 :洗必泰可有效抑制变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株生长。

国产水溶性蜂胶对主要致龋链球菌及其耐氟菌株致龋性的影响

目的了解国产水溶性蜂胶对变形链球菌(S.mutansATCC 25175,S.m)、远缘链球菌(S.sobrinus6715,S.s)及其耐氟菌株的生长抑制作用,以及对葡糖基转移酶(glucosyltransferase,GTF)的影响,探讨一种新的防龋途径。方法采用最小抑菌浓度(MIC)递增法对S.m、S.s进行氟化钠体外诱导耐氟菌株(S.m-FR、S.s-FR),采用液体稀释法观察水溶性蜂胶对S.m、S.m-FR、S.s、S.s-FR生长的影响;用酶化学分析方法检测蜂胶对GTF酶活性的影响。结果水溶性蜂胶对S.m、S.m-FR、S.s、S.s-FRMIC分别为0.39、0.78、0.20、0.39 g/L;最小杀菌浓度(MBC)分别为0.78、1.56、1.56、1.56 g/L;随着蜂胶浓度增高,葡糖基转移酶活性逐渐降低,6.25、3.13、1.56 g/L与0.78、0.39 g/L 2个浓度之间差异具有统计学意义(P<0.05),各浓度组与阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论国产水溶性蜂胶能有效抑制变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株的生长,对GTF具有较强的抑制作用。

变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株质子移位膜ATP酶活性的比较

目的:通过测定并比较变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株体内质子移位膜ATP酶的活性,以阐明耐氟菌株耐酸能力提高的原因。方法:将变链菌株Ingbritt及其耐氟突变株Ingbritt-FR通过甲苯处理,2个循环的液氮冷冻和37℃解冻,制成透性细胞。将透性细胞悬液加到含有10mmol/LMgSO4的50mmol/LTris-maleate测试缓冲液中(pH6.0),加温至37℃,再加入5mmol/LATP(pH6.0)起动反应。分别于10、20、60min取样,测定样品中水解ATP所释出的无机磷量。采用磷钼酸比色法在紫外分光光度计上进行比色分析(660nm),所得数据采用双因素方差分析。结果:在10、20和60min时,耐氟菌株H+-ATP酶活性分别为308.48、136.67和82.80μmolPi/g细胞干重/min,显著高于亲代菌株的相应酶活性:104.77,、64.69和30.70(P<0.01)。随时间推移,两类菌株的H+-ATP酶活性均逐渐降低,在酶的作用时间差别上有统计学意义(P<0.01)。结论:耐氟菌株ATP酶活性增高为其耐酸性增高的原因;H+-ATP酶活性及耐酸性的增高将会增加变链菌耐氟菌株的致龋潜能。

变形链球菌耐氟菌株的筛选及分子鉴定

目的:探讨变形链球菌(S.mutans)获得耐氟性的培养条件及其鉴定方法,为鉴定变形链球菌耐氟菌株提供理论依据。方法:在微需氧条件(95%N2,5%CO2)下,以梯度氟化钠(NaF)浓度对变形链球菌UA159进行培养,获得耐氟菌株。从表现型和基因型上鉴定所培养菌株。观察菌株的表型特征;采用生理生化鉴定和PCR法对该菌株16SrDNA进行克隆鉴定。结果:微需氧(95%N2,5%CO2)条件下培养出耐氟变形链球菌株。形态学观察、生理生化鉴定和16SrDNA鉴定,该菌株具有耐氟稳定性,与变形链球菌UA159的16SrDNA序列同源性是100%,确定该菌株为变形链球菌耐氟菌株。结论:变形链球菌耐氟菌株培养条件是微需氧(95%N2,5%CO2)和脑心浸液(BHI)培养基中培养48h。经NaF诱导的变形链球菌UA159鉴定为变形链球菌UA159的突变株变形链球菌UA159-FR。

变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dgk突变的检测及临床意义

目的:检测变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dgk是否发生突变并推测该基因对变形链球菌耐氟菌株的影响。方法:体外人工诱导变形链球菌耐氟菌株,根据GenBank发表的变形链球菌dgk基因序列设计引物,对其耐氟菌株基因组进行PCR扩增,对扩增产物用DNA回收试剂盒回收鉴定,对回收产物用PGEM-T载体进行T-A克隆,构建重组质粒并测序。结果:PCR扩增获得与预期结果一致的特异性片段并发现8个碱基发生突变,突变位点分别在904(ATA→ATT)、940(GTG→GTC)、946(GAT→GAC)、952(GCC→GCT)、958(GAC→GAT)、964(CAT→CAC)、976(TTG→TTA)、991(AAG→AAA)。提交该序列到GenBank,获得登陆序列号为DQ272517。结论:变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因dgk发生点突变并属于同义突变。

耐氟菌株及其亲代菌株ATP酶基因的DNA测序

目的对变型链球菌耐氟菌株及其亲代菌株的胞膜ATP酶基因进行DNA序列分析。方法分别制备变链菌株Ingbritt及其耐氟菌株IngbrittFR的菌悬液(OD600nm=1.0),经溶菌酶、Lysis消化。按已知ATP酶基因引物设计、扩增ATP酶各片段。将ATP酶基因连接至PUCmT克隆载体,转化后经限制性内切酶酶切鉴定为阳性克隆。采用DG1G1E检测ATP酶基因,DNA测序试剂盒分析DNA序列。结果耐氟菌株与其亲代菌株的核苷酸序列无显著差别。结论ATP酶基因改变不是变链菌株耐氟突变的机制。

氟环境下变形链球菌耐氟菌株ciaH、eno和pykF基因的差异表达及其意义

目的:检测变形链球菌耐氟菌株在氟环境下ciaH、eno和pykF基因表达的差异,探讨ciaH、eno和pykF基因与变形链球菌氟抗性的关系。方法:变形链球菌亲代菌株及其耐氟菌株,分为亲代组(变形链球菌亲代菌株生长于无氟BHI培养基中)、耐氟组(耐氟菌株生长于无氟BHI培养基中)和含氟组(耐氟菌株生长于含氟量为1g·L^(-1)的BHI培养基中)。分别选取3组处于生长对数期(11h)和稳定期(20h)的菌株,采用RT-PCR法检测ciaH、eno和pykF mRNA表达水平。结果:与耐氟组比较,含氟组的耐氟菌株ciaH、eno和pykF mRNA表达水平在对数期和稳定期均明显升高(P<0.05或P<0.01);与亲代组比较,耐氟组的耐氟菌株eno和pykF mRNA表达水平在对数期和稳定期均明显降低(P<0.01),ciaH mRNA表达水平在对数期差异无统计学意义(P>0.05),在稳定期明显升高(P<0.01)。结论:氟能提高耐氟菌株ciaH、eno和pykF基因的表达,该组基因与耐氟菌株氟抗性的产生有关联。

变形链球菌和远缘链球菌耐氟菌株DNAG+C含量测定

目的 探讨变形链球菌和远缘链球菌耐氟菌株基因型是否发生改变。方法 采用高效液相色谱法测定变形链球菌和远缘链球菌及相应耐氟菌株DNA碱基含量 ,即DNAG +C摩尔百分比 (mol% )。结果 四株耐氟菌株DNAG +Cmol%为 5 4.45 ,44 .86 ,5 4.41,5 5 .39;相应亲代菌株G +Cmol%为 35 .8,37.4,43.35和 46 .6 2。两者明显不同 ,差值大于 5 %。结论 变形链球菌和远缘链球菌的耐氟菌株已发生基因型改变 ,且可能包括多个基因的突变。

变形链球菌耐氟菌株的体外诱导

目的体外诱导变形链球菌耐氟菌株。方法在含有不同氟化钠浓度的BHI上逐步诱导变形链球菌产生耐氟菌株,并与亲代菌株进行比较。结果变形链球菌耐氟菌株在体外诱导成功。结论变形链球菌耐氟菌株体外的成功诱导,为耐氟菌株的后续研究奠定了基础。

变形链球菌耐氟菌株脱矿能力的体外研究

目的 :探讨变形链球菌耐氟突变后 ,其致釉质片脱矿能力的改变。方法 :采用原子吸收分光光度计 ,测定不同氟浓度条件下变形链球菌耐氟菌株培养物上清液中钙离子浓度 ,并与亲代菌株进行比较。结果 :耐氟菌株脱矿量在无氟化物存在时 ,小于亲代菌株 ;而当 0 .5mmol/L氟离子存在情况下 ,其脱矿量大于亲代菌株。差异具显著性。结论

变异链球菌耐氟菌株的致龋能力

长期应用氟化物会导致变异链球菌耐氟菌株的产生,此变异是否导致其致龋能力发生变化,并且对于氟化物防龋是否出现新的影响,国内外学者进行了大量的研究。本文就变异链球菌耐氟菌株的产酸能力、脱矿能力、耐酸能力、黏附能力和糖酵解能力等研究进展作一综述。

变形链球菌和远缘链球菌耐氟菌株粘附能力的体外研究

目的 探讨变形链球菌和远缘链球菌耐氟突变后 ,其粘附能力的改变。方法 用同位素标记方法测定变形链球菌、远缘链球菌亲代及耐氟菌株粘附至唾液包被羟基磷灰石 (SHA)表面的粘附量及粘附百分率 ,并比较两者的粘附能力。结果 变形链球菌、远缘链球菌亲代菌株与耐氟菌株间粘附百分率无明显差异 (P >0 .0 5 ) ;远缘链球菌与变形链球菌相比 ,其粘附百分率偏低 ,差异有显著性 (P <0 .0 1)。结论 变形链球菌与远缘链球菌耐氟菌株粘附至SHA表面的能力与亲代野生株无明显区别 。

变形链球菌耐氟菌株对葡萄糖摄取的体外研究

目的 探讨变形链球菌发生耐氟突变后摄取葡萄糖能力的变化。方法 采用逐步法诱导变形链球菌产生耐氟菌株 ,用葡萄糖氧化酶法测定不同PH值 ,有氟和无氟条件下变形链球菌耐氟菌株培养物上清液中葡萄糖减少量 ,并与亲代菌株进行比较。结果 在氟化物存在时 ,耐氟菌株糖摄取量大于亲代菌株 ;耐氟菌株和亲代株在有无氟化物条件下糖摄取量不同 ,差异有显著性 (P <0 .0 0 1)。结论 变形链球菌耐氟菌株具有致龋性 ;其致龋力大于亲代菌株。

变形链球菌耐氟菌株、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株基因组AP-PCR的比较

目的 :利用随机引物聚合酶链反应 ( AP-PCR)技术 ,对变形链球菌、远缘链球菌和耐氟菌株的基因组进行比较 ,判定变形链球菌耐氟突变、远缘链球菌耐氟突变后 ,遗传型是否发生改变。方法 :采用 AP-PCR技术 ,经多次实验自行确立 AP-PCR反应条件 ,对变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株的基因组进行比较。结果 :变形链球菌耐氟菌株、远缘链球菌耐氟菌株的基因组已发生改变。结论 :变形链球菌耐氟突变、远缘链球菌耐氟突变后 ,已具有自身的遗传特性。

氟化物对变形链球菌耐氟菌株的葡萄糖摄入量的影响

目的 :探讨变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株葡萄糖摄入能力的差异。方法 :在 pH为6.0和6.5时将变形链球菌耐氟菌株及亲代菌株在含氟缓冲液和无氟缓冲液培养3h ,采用葡萄糖氧化酶法测定3h中培养物上清液中葡萄糖减少量 ,并对两者进行比较。结果 :在有氟情况下时 ,糖摄入量耐氟菌株显著大于亲代菌株 ,两者比较有显著性差异 (P<0.01)。在有氟和无氟两种条件下耐氟菌株糖摄入量有显著性差异 (P<0.01),亲代株的糖摄入量也有显著性差异 (P<0.01)。结论 :变形链球菌耐氟菌株糖转运能力比亲代菌株强 。

远缘链球菌6715及其耐氟菌株适应性耐酸能力的比较研究

目的:探讨远缘链球菌6715(Streptococcus sobrinus 6715,以下简称S.6715)及其耐氟菌株的适应性耐酸能力。方法:在含有不同氟浓度的TSA上逐步诱导S.6715产生耐氟突变株(以下简称S.6715-FR)。通过测定在各种酸性pH值培养基中预酸化2 h后,能否使S.6715及其耐氟突变株抵抗致死性pH杀伤而存活及存活率,来测定其适应性耐酸能力的有无及大小。结果:S.6715属强适应性耐酸能力类菌株,最大生存率9.98%出现在pH5.5预酸化组,其耐氟突变株S.6715-FR亦具有强适应性耐酸能力,最大生存率10.55%出现在pH值5.0预酸化组。结论:在亚致死性pH值中生长能引发远缘链球菌6715及其耐氟菌株的某些生理变化,产生适应性耐酸能力,抵抗酸性环境的杀伤。

变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因ffh突变的检测

目的检测变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因ffh是否存在突变。方法体外诱导变形链球菌耐氟菌株,碱裂解法提取细菌基因组,根据GenBank上公布的变形链球菌耐酸相关基因ffh的序列,设计一对引物进行PCR,利用PGEM-TEasy载体进行T-A克隆,构建重组质粒,酶切电泳,并测序鉴定。结果变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因ffh发生了突变。结论变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因ffh发生了突变,并可能与其耐酸性增强有关。

远缘链球菌6715耐氟菌株与亲代菌株的基因表达差异

目的比较远缘链球菌6715耐氟菌株与亲代菌株的基因表达差异。方法采用逐步诱导法诱导远缘链球菌6715产生耐氟突变株,分别提取耐氟突变株与亲代菌株菌细胞总RNA并分离纯化mRNA,经逆转录获得cDNA后进行抑制性消减杂交(SSH),比较分析两者的基因表达谱;差异片段通过克隆测序并经在线同源性分析(BLAST)获得片段的基因信息。结果经与GenBank的BLAST比对,确证存在两对差异片段,分属结构基因fruA和SMU.438 c。结论应用SSH技术成功构建远缘链球菌6715耐氟菌株与亲代菌株基因差异表达的cDNA消减文库,为深入研究其耐氟机制奠定了基础。

变形链球菌耐氟菌株gtfB基因失活菌株的构建

目的:构建变形链球菌(S.mutans)耐氟菌株UA159-FR中gtfB基因失活株,为研究耐氟菌株gtfB基因的功能奠定基础。方法:培养UA159-FR并以其为模板扩增gtfB基因上游、下游同源臂片段,以质粒pEGFP-N1为模板扩增kan基因;通过重叠延伸聚合酶链反应法(overlap extension polymerase chain reaction,OE-PCR)获取上述3个片段的同源重组片段;与pEASY-Blunt Cloning Vector连接形成重组质粒后,进行PCR鉴定和测序鉴定;将重组片段电转化入UA159-FR感受态细胞中得到gtfB基因失活菌株,并进行PCR鉴定。结果:经PCR鉴定和测序鉴定,含有gtfB基因重组片段的重组质粒构建成功;经PCR鉴定,UA159-FR的gtfB基因失活株构建成功。结论:成功构建了含有gtfB基因重组片段的重组质粒和S.mutans耐氟菌株UA159-FR的gtfB基因失活株,可用于gtfB基因功能的研究。

氟化物对变形链球菌耐氟菌株生物膜形成的影响

目的:观察变形链球菌耐氟菌株体外成膜过程,并与亲代菌株进行比较;探讨氟化物对耐氟菌株生物膜形成的影响。方法:变形链球菌耐氟菌株及亲代菌株,分为亲代组(变形链球菌亲代菌株生长于无氟BHI培养基中)、耐氟组(耐氟菌株生长于无氟BHI培养基中)和含氟组(耐氟菌株生长于含氟量为1 g/L的BHI培养基中)。通过结晶紫染色、扫描电镜及激光共聚焦显微镜观察3组在6、12、18、24、36、48 h生物膜形成情况,采用SPSS 21.0单因素方差分析进行统计学比较。结果:(1)结晶紫染色法观察到生物膜生物量随时间增加,24~36 h达到最大值且相对稳定。亲代组及耐氟组生物膜生物量无统计学差异( P >0.05);含氟组生物量在实验的6个时间点均明显少于耐氟组( P <0.05)。(2)扫描电镜可见生物膜随时间的延长结构更加复杂,含氟组在实验时间内未见形成完整生物膜。(3)激光共聚焦实验通过细菌活死染观察到6~24 h生物膜呈绿色荧光,以活菌为主;36~48 h生物膜呈黄色荧光,以死菌为主。在不同时间段,实验组之间细菌密度及活菌比例均存在显著的统计学差异( P <0.01)。结论:通过对变形链球菌耐氟菌株及亲代菌株体外成膜情况无明显差异;氟化物对耐氟菌株生物膜的形成有明显的抑制作用。本实验为后续药物对生物膜防治作用的研究及代谢组学的研究奠定基础。