大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ基因核苷酸序列分析与免疫原性研究

对构建的重组质粒ｐＸＳＴ１（含有耐热性肠毒素ＳＴ１和ＬａｃＺ基因）进行核苷酸序列分析的结果表明，该质粒中含有２个正向串联在一起的ＳＴ１基因，且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。免疫学试验结果表明，构建的ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）重组菌株安全无毒。该重组菌株表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，且抗体能中和天然肠毒素ＳＴ１活性，具有较好的免疫保护作用。由此表明。

小肠结肠炎耶尔森菌耐热性肠毒素B基因(ystB)初步研究

目的研究小肠结肠炎耶尔森菌的耐热性肠毒素B基因(ystB)的分布特征。方法通过聚合酶链反应(PCR)、DNA探针杂交方法与序列分析检测致病性和非致病性小肠结肠炎耶尔森菌携带ystB基因的情况。结果98株非致病性小肠结肠炎耶尔森菌中52株携带ystB基因,占53.06%。全部48株致病性小肠结肠炎耶尔森菌均不携带该基因。结论ystB基因仅存在于部分生物1A型非致病性小肠结肠炎耶尔森菌,而不存在于致病性菌株中。

大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)的分子生物学研究进展

大肠杆菌的耐热性肠毒素 (ST)在产肠毒素性大肠杆菌引起的腹泻中扮演重要的角色 ,对人类和家畜的健康构成很大的威胁 .文章从ST的理化特性、致病机理等一般生物学特性到基因克隆、定点突变以及分子结构与功能的关系等分子生物学特征 ,全面概述了ST的分子生物学研究进展 ,对于从分子水平全面了解ST的结构、性质、致病机理以及免疫原性等生物学性状具有重要意义 .

表达大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合蛋白基因工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆茵耐热性肠毒素１（ＳＴ＿１）－β－半乳糖苷酶融合蛋白基因工程菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ（ｐＸＳＴ＿１）经轧鼠灌胃试验证实没有毒性反应。采用超声波粉碎法裂解菌体，再辅以氢氧化铝胶制冬抗原，免疫接种ＢＡＬＢ／ｃ鼠，获得抗融合蛋白抗体，乳鼠灌胃中和试验结果表明，该抗体能中和天然ＳＴ＿１肠毒素活性，具有较好的免疫保护作用。以该菌株免疫的雌性ＥＡＬＢ／ｃ鼠产下的乳鼠吮吸初乳后，能够抵抗１个鼠活性单位ＳＴ＿１肠毒素的攻击。Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ（ｐＸＳＴ＿１）工程菌株可作为预防大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的侯选菌株。

大肠杆菌耐热性肠毒素的研究进展

随着分子生物学的发展 ,近年来 ,对大肠杆菌耐热性肠毒素的研究已从细胞水平 ,分子水平进入基因水平 ,在其分子结构与功能、理化特性、提纯方法与鉴定、致病机理、分子生物学等方面进行了大量的研究 ,本文就大肠杆菌耐热性肠毒素的研究概况作一简要的介绍。

抗大肠杆菌耐热性肠毒素ST1 McAb杂交瘤细胞系的建立及应用

目的耐热性肠毒素ST1单克隆抗体制备及在感染性腹泻诊断中的应用。方法应用基因工程菌株分泌的肠毒素制备ST1包涵体,免疫Balb/c小鼠,成功制备了3株特异性抗ST1的单克隆抗体细胞株,用其中1株McAb建立了检测ST1的双单克隆抗体夹心ELISA法。结果检测52株从临床腹泻病人粪便中分离的大肠杆菌,检出ST1阳性率为26.92%,与ST1检测的经典方法乳鼠灌胃法符合率为96.15%。结论该方法是一种简捷、灵敏和特异的检测方法,具有实际应用价值。

大肠杆菌耐热性肠毒素ST Ⅰ突变体与黏附素K99融合基因的构建及其表达

采用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌C83922质粒中扩增出耐热性肠毒素(STⅠ)和黏附素K99基因片段,进一步结合基因重组技术成功构建了含有融合基因ST Ⅰ-Linker-K99的重组质粒pMSLK;通过PCR和寡核苷酸定点突变技术将STⅠ毒素中心的6个Cys分别突变成Ser和Gly,经亚克隆后将含有突变位点的融合基因插入到pET-20b表达载体中,获得了重组质粒pES(S)LK和pES(G)LK;将以上2种质粒分别导入到BL21(DE3)菌株中,成功构建BL21(DE3)(pES(S)LK)和BL21(DE3)(pES(G)LK)2种重组菌株,对其表达产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。结果表明:这两种重组菌株都能高效表达ST Ⅰ突变体与K99的重组蛋白,而且表达的融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922抗血清特异性识别。

大肠杆菌耐热性肠毒素ST_(1b)基因的亚克隆、重组及其核苷酸序列分析

产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）是幼畜、婴幼儿及旅游者腹泻的重要病原菌之一。作者以大肠杆菌pSLM004菌株为始发菌株,利用合成的一对与ST1基因特定序列相匹配的引物,通过PCR扩增出了ST1b基因。该基因片段扩增物（150bp）经适当方法纯化,与克隆载体pUC18的HlincⅡ位点平端连接,转化到受体菌JM101中。

表达大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ－β－半乳糖苷酶融合蛋白菌株的构建

将含大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ（ＳＴⅠ）结构基因的质粒ｐＢＳＴ２－６用限制性内切酶ＢａｍｍＨⅠ和ＢｇｌⅡ消化，经３％琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收１４７ｂｐＳＴⅠ基因片段，再将含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨⅠ消化、碱性磷酸酶处理，然后将处理的ｐＵＣ１８ＤＮＡ与１４７ｂｐＳＴⅠＤＮＡ通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接，转化至受体菌ＤＨ５α。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个为ＳＴⅠ基因探针杂交阳性的菌株。杂文阳性的菌株经培养和抽提纯化质粒后，经限制性内切酶分析和ＤＮＡ序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴⅠ含有２个连接在一起的ＳＴⅠ基因片段，其连接方向是正向的，具有正确的阅读框架。又ＤＨ５α（ｐＸＳＴⅠ）菌株能在含Ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上呈蓝色菌落．表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ－β－半乳糖苷酶融合蛋白。

大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)的检测

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)是通过产生肠毒素而致婴幼儿、旅游者及幼畜腹泻的,临床检测表明,到发展中国家旅游者中的急性腹泻,至少有1/3～1/2是ETEC引起的。ETEC能产生两种肠毒素:热敏性肠毒素(Heat-Labile Enterotoxin,LT),为大分子具有免疫原性毒素,其作用机理、理化住质以及免疫学特性和检测方法均与霍乱毒素(CT)相似;耐热性肠毒素(Heat-Stable Enterotoxin,ST)。

产肠毒素性大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)提纯方法研究

本文运用硫酸铵沉淀、羟基磷灰右处理、酒精抽提、Sp-sephadex C-25阳离子交换凝胶柱及DEAE-Sephadex A-25阴离子交换凝胶柱交换洗脱以及高压液相色谱法进行产肠毒素大肠杆菌(ETEC)耐热性肠毒素(ST)的纯化,从10000ml细菌培养液中获得纯化ST1.05mg。

大肠杆菌耐热性肠毒素STI三重串联突变体与黏附素K99融合基因的表达研究

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是一种导致仔畜和婴儿腹泻的主要病原之一,它的毒力因子主要有两类:黏附素(CFAs)和耐热性肠毒素(ST)或不耐热性肠毒素(LT)。通过PCR技术及双酶切连接技术,成功构建了含有3个STI突变体和1个黏附素K99基因的重组表达质粒pE3S(S)LK和pE3S(G)LK。重组菌株BL21(DE3)(pE3S(S)LK)和BL21(DE3)(pE3S(G)LK)的表达产物经SDS-PAGE和免疫印迹分析,表明以上两种重组菌株均能高效表达3STI(S)-K99和3STI(G)-K99融合蛋白,且融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922抗血清特异性识别。其次,利用乳鼠灌胃实验检测重组蛋白的生物学毒性,结果均为阴性(G/C值≤0.083),这表明该菌株已无STI生物学毒性。这些为研发预防大肠杆菌性腹泻的新型高效多价基因工程疫苗提供了基本素材和理论指导。

大肠埃希菌不耐热肠毒素作为黏膜免疫佐剂的研究进展

免疫佐剂是一类通过刺激机体免疫系统而非特异性地增强机体对抗原免疫应答的活性物质,也是近年来研究的热点。免疫佐剂种类众多,利用细菌及其代谢产物作为黏膜免疫佐剂具有很好的发展前景,研究较多的是霍乱毒素(CT)和大肠埃希菌不耐热肠毒素(LT),从研究效果看,LT比CT更为理想。但是LT和CT一样本身具有毒性,这是其作为黏膜佐剂的主要缺点。目前,国内外研究工作者对其突变体做了大量研究,以期找到具有黏膜佐剂活性但低毒或无毒的大肠埃希菌不耐热肠毒素突变体。文章对大肠埃希菌不耐热肠毒素分子及其突变体的研究做一综述。

产肠毒素大肠埃希菌STa-K99融合蛋白重组腺病毒载体的构建及表达

为构建产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)STa-K99融合蛋白重组腺病毒载体Ad STa-K99,通过PCR技术分别克隆了STa及K99基因,并与腺病毒穿梭质粒连接构建了穿梭质粒pAd5 STa-K99,将pAd5STa-K99和骨架质粒(含GFP基因)分别用PacⅠ酶切线性化,利用LipofectamineTM LTX&PLUS共转染293细胞进行同源重组包装重组腺病毒,通过PCR及Western blot对重组腺病毒进行鉴定。结果显示,重组腺病毒Ad5STa-K99构建正确并表达融合蛋白,且表达的融合蛋白能够被抗体所识别,为研制由ETEC引起的新生动物腹泻重组腺病毒载体疫苗奠定了基础。

表达产肠毒素性大肠埃希菌STa-K99融合蛋白重组腺病毒的免疫学特性研究

为研究表达产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC)耐热性肠毒素STa与粘附素K99融合蛋白重组腺病毒r Ad.STa-K99的免疫学特性,本实验将r Ad.STa-K99经肌肉注射免疫小鼠,采用ELISA法分别检测了特异性Ig G、SIg A、脾脏淋巴细胞增殖活性水平及CD4+、CD8+T淋巴细胞分型比值;并通过攻毒保护试验对其免疫效果进行评价。结果表明,免疫后小鼠特异性Ig G、SIg A及脾脏淋巴细胞增殖活性水平显著升高;CD4+/CD8+值显著增大;动物攻毒保护率达到70%。结果表明r Ad.STa-K99可以刺激小鼠机体产生较高水平的体液免疫、特异性细胞免疫和肠道粘膜免疫反应,并对小鼠提供有效保护。本实验为研制预防由ETEC引起的新生动物腹泻重组腺病毒疫苗奠定了基础。

大肠杆菌肠毒素的免疫学研究进展

大肠杆菌肠毒素分为耐热肠毒素（ＳＴ）和不耐热性肠毒素（ＬＴ），ＳＴ不具有抗原，而ＬＴ具有抗原性。ＳＴ是引起人、畜腹泻的重要致病因子。人们希望通过基因体外融合技术和化学偶联方法，使ＳＴ成为一种良好抗原。本文对此研究进展作了概述。

利用重组PCR技术构建大肠杆菌肠毒素LT_B0ST_I融合基因

利用重组PCR技术将从原始菌种中扩增得到的LTB、STI 基因片段连接起来 ,构建了LTB STI 融合基因。并将其克隆到 pUCm T载体上 ,转化到大肠杆菌DH5α中 ,得到克隆T LS ,序列分析表明该克隆具有正确的基因序列和阅读框 ,具有起始密码子ATG和终止密码子TAA 。

大肠杆菌肠毒素二价苗构建的研究进展(综述)

产肠毒素性大肠杆菌 (ETEC)是引起幼畜、婴幼儿及旅游者腹泻的重要病原菌之一。肠毒素是其主要的毒力因子 ,包括耐热性肠毒素 (ST)和热敏感肠毒素 (L T)。STI基因和 L TB基因融合后产生的融合蛋白不仅增强了 STI 的免疫原性 ,而且降低了 STI 的生物毒性 ,这就给抗幼畜腹泻的基因工程亚单位苗开发带来了新的希望。