平板免疫溶血试验快速检测大肠杆菌不耐热肠毒素

琼脂糖为介质，进行固相平板免疫溶血试验测定毒素源性大肠杆菌不耐热肠毒素（ＬＴ），同时与ＥＬＩＳＡ，兔肠结扎试验测定ＬＴ进行了比较。结果表明，平板免疫溶血试验特异性强，标准的ＥＴＥＣ发生溶血，非ＥＴＥＣ不发生溶血，灵敏度与ＥＬＩＳＡ相似，比肠结扎试验敏感８倍左右；对１５１份样品的检测说明平板免疫溶血试验与ＥＬＩＳＡ具有很高的符合性。此外对不同来源的红血球用于测定ＬＴ进行了研究。

副溶血弧菌不耐热溶血毒素的表达与纯化

目的 表达和纯化融合表达的副溶血弧菌不耐热溶血毒素。方法 将表达载体 pET3 2a + -tlh转化大肠杆菌BL2 1(λDE3) ,诱导表达副溶血弧菌不耐热溶血毒素 ,表达产物用聚丙稀酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)鉴定 ,8mmol/L的尿素溶解包涵体 ,用 6×his组氨酸蛋白质镍亲和层析树脂亲和层析纯化目的蛋白。结果 诱导表达的目的蛋白以包涵体形式存在 ,其含量约占菌体总蛋白的 10 % ,纯化获得了高纯度的融合表达的副溶血弧菌不耐热溶血毒素。结论 转化有重组质粒pET3 2a + -tlh的BL2 1(λDE3)可稳定高效地表达目的蛋白 ,采用低浓度的咪唑、β -巯基乙醇和Tritonx -10 0等方法减少杂蛋白污染 ,亲和层析纯化目的蛋白 。

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素基因的克隆及原核表达

根据GenBank上已有的副溶血弧菌耐热直接溶血毒素的基因序列,设计并人工合成引物。将耐热直接溶血毒素的基因全长克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达载体tdhA/pGEX-4T-1和tdhS/pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达的工程菌株。优化诱导表达条件,表达耐热直接溶血毒素。转化有重组质粒tdhA/pGEX-4T-1,tdhS/pGEX-4T-1的BL21可稳定高效地表达可溶形式的目的蛋白。表达产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,用GST琼脂糖珠柱亲和层析纯化。溶血实验表明,表达的蛋白具有溶血活性。

融合表达的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素包涵体复性的研究

目的构建融合表达载体,获得具有生物活性的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素。方法克隆tlh基因,构建表达载体pET32a+/tlh,融合表达副溶血弧菌不耐热性溶血毒素,用8 mol/L的尿素溶解包涵体,亲和层析纯化目的蛋白,采取逐步透析、降低蛋白浓度、加入氧化还原剂等复性方法。结果复性蛋白具有溶血活性及免疫原性。结论通过克隆tlh基因,构建融合表达载体pET32a+-tlh,采取纯化、复性方法,获得具有融血活性及免疫原性的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素。

用斑点ELISA检测副溶血弧菌的耐热溶血毒(TDH)和TDH类似毒(TRH)

本文用斑点ELISA和溶血试验分别检测26株副溶血弧菌（VibrioParahaemolyticus，VP）的耐热溶血毒（TDH）和TDH类似溶血毒（TRH），TDH的阳性检出率分别为80．8％（21／26）和73．1％（19／26）TRH的阳性检出率分别为19．2％（5／26）和7．7％（2／26）。经卡方检验，两试验在统计学上无显著性差异（P＞0．05）。实验结果表明，斑点ELISA比溶血试验稳定，影响因素少。

产耐热溶血毒素副溶血弧菌耐药性调查

目的:了解临床引起急性腹泻的副溶血弧菌产耐热溶血毒素的(TDH)情况和耐药现状。方法:用常规方法对临床大便标本进行培养及分离,Vitek-2全自动微生物仪进行鉴定,TDH用我妻培养基检测,药物敏感性试验采用K-B法(结果参照NCCLS肠杆菌科标准判读)。结果:①分离出的167株副溶血弧菌中96.4%(161/167)产耐热溶血毒素;②副溶血弧菌对临床常用23种抗生素的体外抗菌活性除了氨苄西林、头孢唑林、头孢噻吩、头孢呋新较低,敏感率小于10.6%,其他均较高,敏感率在84.5%以上。结论:引起急性腹泻的副溶血弧菌大部分都产TDH,临床常用的抗菌素对其均有较好的体外抗菌活性。

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素的急性毒性研究

为研究耐热直接溶血毒素(TDH)对实验小鼠的急性毒性,经腹腔注射实验小鼠不同浓度梯度的TDH(42.0、19.5、9.1、4.2和1.9 mg·kg^-1体重,对照组设为PBS),连续观察14 d,记录各组小鼠的死亡情况及生理反应。实验终止时进行大体解剖,摘取心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏观测脏器指数,断尾采血并计数血细胞。结果表明,TDH对昆明种小鼠的半数致死量LD50为11.0 mg·kg^-1体重,小鼠的死亡主要集中发生在注射TDH后的72 h内,并且伴随着腹泻现象。各组存活的实验小鼠在注射TDH后的第5天后,精神状态基本恢复,正常进食进水。各组小鼠脏器未见明显炎症反应,小鼠血液中红细胞与白细胞数量也未见统计学差异。TDH的毒性靶器官是心脏、肺、肾脏、脾脏、胃和肠。TDH对小鼠的半数致死量和毒性靶器官及病理学表现可为TDH的进一步实际应用及研究提供科学的依据和资料。

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素抑制人肺腺癌细胞活性的研究

目的海洋细菌毒素抗肿瘤是近年来兴起的用于癌症治疗的新思路。本文旨在研究耐热直接溶血毒素(TDH)对人肺腺癌细胞SPC-A-1细胞的抑制作用。方法利用DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex A-50、葡聚糖G-75层析的方法,从海洋细菌-副溶血弧菌ATCC33846的代谢物中分离纯化得到纯度较高的耐热直接溶血毒素(TDH)。通过MTT法、细胞划痕试验、凋亡试验、caspase-3活性试验比较TDH作用于不同细胞的半抑制剂浓度IC50,研究了TDH对人肺腺癌细胞SPC-A-1细胞的作用。结果人结肠上皮细胞NCM460、人肝成纤维细胞LO2、人肺腺癌细胞SPC-A-1在TDH处理24h之后,细胞的半抑制剂浓度IC50分别为151μg/mL、118μg/mL和6.7μg/mL,正常细胞的IC50高出肺腺癌细胞近20倍。在低于5μg/mL浓度下,TDH能剂量依赖性抑制SPC-A-1细胞的生长、增殖和迁移能力。流式细胞法和荧光试剂检测表明:5μg/mL的TDH能诱导33%的SPC-A-1细胞发生早期凋亡,并激活caspase-3。结论 TDH可能通过激活caspase-3途径诱导细胞凋亡,从而抑制SPC-A-1细胞的生长和增殖。

副溶血性弧菌产耐热直接溶血毒素对黑色素瘤的抑制作用研究

为探讨耐热直接溶血毒素(Thermostabile direct hemolysin,TDH)在体内和体外对小鼠黑色素瘤细胞B16的抑制作用,本研究通过MTT法、克隆形成试验、凋亡试验、Caspase-8和Caspase-3的活性试验、线粒体膜电位的检测以及体内C57BL/6小鼠(Mus musculus)荷瘤实验,比较TDH作用于不同细胞的半抑制浓度(IC50),评价TDH对小鼠黑色素瘤细胞B16的体内外抑制作用。结果发现:人结肠上皮细胞NCM460、人正常肝细胞LO2、人肝癌细胞SMMC-7721和小鼠黑色素瘤细胞B16在TDH处理24 h之后,细胞的半抑制质量浓度IC50分别为151、118、54和48μg/mL,正常细胞的IC50高出癌细胞近2~3倍。当质量浓度低于20μg/mL时,TDH以剂量依赖性的方式抑制B16细胞的克隆形成,6 mg/kg TDH在移植瘤模型中显著抑制体内肿瘤的生长(P<0.001)。流式细胞术和荧光试剂盒检测表明:20μg/mL的TDH能诱导19.4%的B16细胞发生早期凋亡,并激活Caspase-8和Caspase-3,但不影响线粒体膜电位。TDH具有体内外的抗肿瘤活性,可能通过细胞表面的死亡受体介导的凋亡信号通路引起凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。

副溶血弧菌的溶血毒素研究现况

副溶血弧菌可引起食物中毒、反应性关节炎和心脏疾病 ,其致病因子是该菌产生的多种溶血毒素 ,主要有不耐热溶血毒素、耐热直接溶血毒素、相对耐热直接溶血毒素。

检测副溶血弧菌TDH斑点免疫胶体金渗滤法的研究

目的:制备特异性检测副溶血弧菌TDH的斑点免疫胶体金渗滤测试盒(Dot immunogold filtration assay,DIG-FA)。方法:T6D4和T9H4两株抗体分别标记于金颗粒和点样于硝酸纤维素膜,通过双抗体夹心法来开发斑点免疫胶体金渗滤测试盒,并对测试盒的特异性、重复性、稳定性做了分析。结果:研制的斑点免疫胶体金渗滤测试盒能够特异性检测副溶血弧菌TDH,其最低检测限达到250 ng/ml TDH,该测试盒在4℃恒温条件下保存12周后仍表现出准确和稳定的检测结果。结论:成功制备了检测副溶血弧菌TDH的斑点免疫胶体金渗滤测试盒,对现场快速检测TDH提供了可靠的测试工具。

利用免疫磁珠法分离环境及食品中产生TDH副溶血性弧菌的研究

采用免疫磁珠法分别从 1份海水、 1份海泥和 3份蛤肉中检出了神奈川现象阳性 ,并产生耐热直接溶血毒素 (TDH )的副溶血性弧菌 ,血清型为O3 :K6。该方法与一般的细菌培养分离法相比 ,极大地提高了环境样品及食品中病原性副溶血性弧菌的检出率 。

环介导恒温扩增技术可视化检测携带tdh基因的致病性副溶血性弧菌

建立了环介导恒温扩增技术检测携带tdh基因的致病性副溶血性弧菌。基于副溶血性弧菌高度保守的tdh基因序列,设计了6条特异性引物,两条外引物F3、B3,两条内引物FIP、BIP及两条环引物LF、LB。在Bst DNA Polymerase作用下,60℃恒温水浴进行扩增。对10种细菌共21株菌进行LAMP扩增,所试6株副溶血性弧菌均为阳性,说明引物具有高度特异性。本LAMP方法对纯培养物的灵敏度可达到9.42cfu/m L。对污染食品中副溶血性弧菌的灵敏度为25.3cfu/25g,40～60min内即可完成检测。本方法操作简便、特异性强、灵敏度高,可以为临床提供简单、快速、高灵敏度和高特异性的检测应用。

副溶血弧菌TDH的原核表达及单克隆抗体的制备

为实现副溶血性弧菌tdh基因的原核表达,采用TCBS选择培养基从贝类中筛选副溶血性弧菌疑似菌株;根据Gen Bank上已有的tdh基因序列,设计并人工合成引物,通过PCR技术鉴定副溶血性弧菌并扩增tdh基因;酶切后定向插入到p ET-28a表达载体中,构建重组表达质粒p ET-28a-tdh,转入E.coli Rosetta中,在IPTG诱导下进行TDH蛋白表达。为制备耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体,用纯化的蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,成功用原核载体表达的TDH蛋白为免疫原,制得一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为T9N10。获取腹水并经Ni-NTA Resin亲和柱纯化,其稳定分泌的单克隆抗体经鉴定为Ig G1,相对分子质量约为146 000,并表现出较强的特异性。本研究为开发副溶血弧菌免疫学快速检测和深入的研究奠定良好的物质基础。

副溶血弧菌TDH快速免疫胶体金检测板的研制

目的:开发特异性检测副溶血弧菌耐热直接溶血毒素(TDH)的快速免疫胶体金检测板。方法:利用本实验室前期制备的两株TDH单克隆抗体T6D4和T9H4,以双抗体夹心法研制胶体金检测板。结果:研制出的快速免疫胶体金检测板能够特异性地检测TDH,检测限为500 ng/ml。结论:成功研制出能够特异性检测副溶血弧菌TDH的快速免疫胶体金检测板,为TDH的快速检测提供了新的测试工具。

副溶血弧菌LAMP检测方法的建立

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种能引起食源性疾病的重要病原菌。首次将一种新颖的核酸扩增技术-环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)应用于副溶血弧菌的快速检测。针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因(tlh)设计4条特异性引物(两条内引物和两条外引物)进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化,最佳反应时间为60min,反应温度为60℃。对12种细菌共28株菌进行LAMP扩增,仅14株副溶血弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。副溶血弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为90fg和24cfu/ml。对模拟食品样品进行直接检测,检测限为89cfu/g。结果表明,该方法检测副溶血弧菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1小时即可完成,有望发展成为快速检测副溶血弧菌的有效手段。

武汉市6起食物中毒副溶血弧菌分子特征研究

目的:了解武汉地区6起食物中毒病原菌副溶血弧菌分子特征。方法:对6起食物中毒共16株分离株进行药敏分析,运用PCR技术进行耐热性溶血毒素基因(tdh)和耐热性溶血毒素相关溶血素基因(trh)检测,并进行肠道细菌重复基因间共同序列PCR(ER IC-PCR)分析。结果:16株副溶血弧菌对第三代头孢和喹诺酮类较敏感,tdh阳性,trh阴性,ER IC-PCR结果显示每起食物中毒菌株亲缘关系非常紧密,有3起属于同一个群,另外2起属于一个群。结论:武汉地区流行的主要副溶血弧菌分子特征为tdh阳性,trh阴性,ER IC-PCR技术是分析副溶血弧菌引起食物中毒菌株非常有效的工具。

抗副溶血弧菌TLH蛋白多克隆抗体的制备及其ELISA双抗体夹心检测法的研究

目的分别制备抗副溶血弧菌及其不耐热溶血毒素(thermolabile hemolysin,TLH)的多克隆抗体,建立检测副溶血弧菌TLH的酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法。方法以副溶血弧菌及其TLH分别免疫健康雄性新西兰大白兔和雌性BALB/C小鼠,制备兔抗副溶血弧菌多克隆抗体及小鼠抗TLH多克隆抗体,以间接ELISA法检测两种抗体效价,并以棋盘法筛选两种多克隆抗体用于夹心检测TLH的效价。结果兔抗副溶血弧菌多克隆抗体效价达1∶6400,鼠抗TLH多克隆抗体效价为1∶102 400,经筛选确定以1∶800稀释的兔抗副溶血弧菌多克隆抗体包被酶标板,与1∶1600稀释的鼠抗TLH抗体建立了ELISA双抗体夹心法。结论兔抗副溶血弧菌多克隆抗体可与TLH呈特异性反应,以此建立的双抗体夹心法检测副溶血弧菌TLH可获较满意结果,此实验可为进一步建立简便、快速的副溶血弧菌检测方法奠定基础。