副溶血弧菌耐热直接溶血毒素基因的克隆及原核表达

根据GenBank上已有的副溶血弧菌耐热直接溶血毒素的基因序列,设计并人工合成引物。将耐热直接溶血毒素的基因全长克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达载体tdhA/pGEX-4T-1和tdhS/pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达的工程菌株。优化诱导表达条件,表达耐热直接溶血毒素。转化有重组质粒tdhA/pGEX-4T-1,tdhS/pGEX-4T-1的BL21可稳定高效地表达可溶形式的目的蛋白。表达产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,用GST琼脂糖珠柱亲和层析纯化。溶血实验表明,表达的蛋白具有溶血活性。

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素的急性毒性研究

为研究耐热直接溶血毒素(TDH)对实验小鼠的急性毒性,经腹腔注射实验小鼠不同浓度梯度的TDH(42.0、19.5、9.1、4.2和1.9 mg·kg^-1体重,对照组设为PBS),连续观察14 d,记录各组小鼠的死亡情况及生理反应。实验终止时进行大体解剖,摘取心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏观测脏器指数,断尾采血并计数血细胞。结果表明,TDH对昆明种小鼠的半数致死量LD50为11.0 mg·kg^-1体重,小鼠的死亡主要集中发生在注射TDH后的72 h内,并且伴随着腹泻现象。各组存活的实验小鼠在注射TDH后的第5天后,精神状态基本恢复,正常进食进水。各组小鼠脏器未见明显炎症反应,小鼠血液中红细胞与白细胞数量也未见统计学差异。TDH的毒性靶器官是心脏、肺、肾脏、脾脏、胃和肠。TDH对小鼠的半数致死量和毒性靶器官及病理学表现可为TDH的进一步实际应用及研究提供科学的依据和资料。

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素抑制人肺腺癌细胞活性的研究

目的海洋细菌毒素抗肿瘤是近年来兴起的用于癌症治疗的新思路。本文旨在研究耐热直接溶血毒素(TDH)对人肺腺癌细胞SPC-A-1细胞的抑制作用。方法利用DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex A-50、葡聚糖G-75层析的方法,从海洋细菌-副溶血弧菌ATCC33846的代谢物中分离纯化得到纯度较高的耐热直接溶血毒素(TDH)。通过MTT法、细胞划痕试验、凋亡试验、caspase-3活性试验比较TDH作用于不同细胞的半抑制剂浓度IC50,研究了TDH对人肺腺癌细胞SPC-A-1细胞的作用。结果人结肠上皮细胞NCM460、人肝成纤维细胞LO2、人肺腺癌细胞SPC-A-1在TDH处理24h之后,细胞的半抑制剂浓度IC50分别为151μg/mL、118μg/mL和6.7μg/mL,正常细胞的IC50高出肺腺癌细胞近20倍。在低于5μg/mL浓度下,TDH能剂量依赖性抑制SPC-A-1细胞的生长、增殖和迁移能力。流式细胞法和荧光试剂检测表明:5μg/mL的TDH能诱导33%的SPC-A-1细胞发生早期凋亡,并激活caspase-3。结论 TDH可能通过激活caspase-3途径诱导细胞凋亡,从而抑制SPC-A-1细胞的生长和增殖。

副溶血性弧菌产耐热直接溶血毒素对黑色素瘤的抑制作用研究

为探讨耐热直接溶血毒素(Thermostabile direct hemolysin,TDH)在体内和体外对小鼠黑色素瘤细胞B16的抑制作用,本研究通过MTT法、克隆形成试验、凋亡试验、Caspase-8和Caspase-3的活性试验、线粒体膜电位的检测以及体内C57BL/6小鼠(Mus musculus)荷瘤实验,比较TDH作用于不同细胞的半抑制浓度(IC50),评价TDH对小鼠黑色素瘤细胞B16的体内外抑制作用。结果发现:人结肠上皮细胞NCM460、人正常肝细胞LO2、人肝癌细胞SMMC-7721和小鼠黑色素瘤细胞B16在TDH处理24 h之后,细胞的半抑制质量浓度IC50分别为151、118、54和48μg/mL,正常细胞的IC50高出癌细胞近2~3倍。当质量浓度低于20μg/mL时,TDH以剂量依赖性的方式抑制B16细胞的克隆形成,6 mg/kg TDH在移植瘤模型中显著抑制体内肿瘤的生长(P<0.001)。流式细胞术和荧光试剂盒检测表明:20μg/mL的TDH能诱导19.4%的B16细胞发生早期凋亡,并激活Caspase-8和Caspase-3,但不影响线粒体膜电位。TDH具有体内外的抗肿瘤活性,可能通过细胞表面的死亡受体介导的凋亡信号通路引起凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。

副溶血性弧菌直接溶血毒素65位氨基酸突变体的构建

目的 将副溶血性弧菌直接溶血毒素 6 5位氨基酸进行突变。方法 酶切 tdh基因获得tdhm2 6 8- 5 70 bp,一对突变引物扩增出 tdhm 1- 2 6 7bp,与载体 p U C19连接并转化大肠杆菌 JM10 9;对重组质粒进行测序鉴定。结果 DNA测序结果表明 tdhm和 tdh的序列有 2个碱基的差别。结论 按照预期设计成功突变了副溶血性弧菌的直接溶血毒素的 6 5位氨基酸 。

环介导恒温扩增技术可视化检测携带tdh基因的致病性副溶血性弧菌

建立了环介导恒温扩增技术检测携带tdh基因的致病性副溶血性弧菌。基于副溶血性弧菌高度保守的tdh基因序列,设计了6条特异性引物,两条外引物F3、B3,两条内引物FIP、BIP及两条环引物LF、LB。在Bst DNA Polymerase作用下,60℃恒温水浴进行扩增。对10种细菌共21株菌进行LAMP扩增,所试6株副溶血性弧菌均为阳性,说明引物具有高度特异性。本LAMP方法对纯培养物的灵敏度可达到9.42cfu/m L。对污染食品中副溶血性弧菌的灵敏度为25.3cfu/25g,40～60min内即可完成检测。本方法操作简便、特异性强、灵敏度高,可以为临床提供简单、快速、高灵敏度和高特异性的检测应用。

副溶血弧菌的溶血毒素研究现况

副溶血弧菌可引起食物中毒、反应性关节炎和心脏疾病 ,其致病因子是该菌产生的多种溶血毒素 ,主要有不耐热溶血毒素、耐热直接溶血毒素、相对耐热直接溶血毒素。

检测副溶血弧菌TDH斑点免疫胶体金渗滤法的研究

目的:制备特异性检测副溶血弧菌TDH的斑点免疫胶体金渗滤测试盒(Dot immunogold filtration assay,DIG-FA)。方法:T6D4和T9H4两株抗体分别标记于金颗粒和点样于硝酸纤维素膜,通过双抗体夹心法来开发斑点免疫胶体金渗滤测试盒,并对测试盒的特异性、重复性、稳定性做了分析。结果:研制的斑点免疫胶体金渗滤测试盒能够特异性检测副溶血弧菌TDH,其最低检测限达到250 ng/ml TDH,该测试盒在4℃恒温条件下保存12周后仍表现出准确和稳定的检测结果。结论:成功制备了检测副溶血弧菌TDH的斑点免疫胶体金渗滤测试盒,对现场快速检测TDH提供了可靠的测试工具。

利用免疫磁珠法分离环境及食品中产生TDH副溶血性弧菌的研究

采用免疫磁珠法分别从 1份海水、 1份海泥和 3份蛤肉中检出了神奈川现象阳性 ,并产生耐热直接溶血毒素 (TDH )的副溶血性弧菌 ,血清型为O3 :K6。该方法与一般的细菌培养分离法相比 ,极大地提高了环境样品及食品中病原性副溶血性弧菌的检出率 。

副溶血弧菌TDH的原核表达及单克隆抗体的制备

为实现副溶血性弧菌tdh基因的原核表达,采用TCBS选择培养基从贝类中筛选副溶血性弧菌疑似菌株;根据Gen Bank上已有的tdh基因序列,设计并人工合成引物,通过PCR技术鉴定副溶血性弧菌并扩增tdh基因;酶切后定向插入到p ET-28a表达载体中,构建重组表达质粒p ET-28a-tdh,转入E.coli Rosetta中,在IPTG诱导下进行TDH蛋白表达。为制备耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体,用纯化的蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,成功用原核载体表达的TDH蛋白为免疫原,制得一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为T9N10。获取腹水并经Ni-NTA Resin亲和柱纯化,其稳定分泌的单克隆抗体经鉴定为Ig G1,相对分子质量约为146 000,并表现出较强的特异性。本研究为开发副溶血弧菌免疫学快速检测和深入的研究奠定良好的物质基础。

副溶血弧菌TDH快速免疫胶体金检测板的研制

目的:开发特异性检测副溶血弧菌耐热直接溶血毒素(TDH)的快速免疫胶体金检测板。方法:利用本实验室前期制备的两株TDH单克隆抗体T6D4和T9H4,以双抗体夹心法研制胶体金检测板。结果:研制出的快速免疫胶体金检测板能够特异性地检测TDH,检测限为500 ng/ml。结论:成功研制出能够特异性检测副溶血弧菌TDH的快速免疫胶体金检测板,为TDH的快速检测提供了新的测试工具。

双重PCR检测海产品中携带trh毒力基因副溶血性弧菌的研究

为建立有效鉴别副溶血性弧菌及携带耐热相关溶血毒素基因的毒性弧菌的方法,用副溶血性弧菌种属特异性基因tlh及毒性基因trh设计引物进行双重PCR检测,对双重PCR体系进行优化,并对其特异性及PCR灵敏度进行检测,验证双重PCR体系检测能力及对人工污染样品的灵敏度。结果表明,该方法对海产品中的副溶血性弧菌及携带trh毒性基因的弧菌具有检测特异性,且灵敏度较高,可为食品检测提供一定的参考依据。

副溶血弧菌LAMP检测方法的建立

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种能引起食源性疾病的重要病原菌。首次将一种新颖的核酸扩增技术-环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)应用于副溶血弧菌的快速检测。针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因(tlh)设计4条特异性引物(两条内引物和两条外引物)进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化,最佳反应时间为60min,反应温度为60℃。对12种细菌共28株菌进行LAMP扩增,仅14株副溶血弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。副溶血弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为90fg和24cfu/ml。对模拟食品样品进行直接检测,检测限为89cfu/g。结果表明,该方法检测副溶血弧菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1小时即可完成,有望发展成为快速检测副溶血弧菌的有效手段。

Western斑点印迹法检测致病性副溶血弧菌

目的:对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的直接耐热溶血毒素(thermostable direct hemolysin,TDH)进行分离纯化,建立Western斑点印迹法技术检测致病性副溶血弧菌的方法。方法:用直接耐热溶血毒素免疫小鼠得到特异性抗血清,利用棋盘方法确定免疫血清最佳工作浓度,并对致病性与非致病性副溶血弧菌分别进行特异性测定。结果:最佳免疫血清最佳工作浓度为1:3200;检测致病性副溶血弧菌为阳性,非致病性副溶血弧菌属呈阴性。结论:Western斑点印迹法技术可以特异性检测致病性副溶血弧菌,灵敏度高、操作简单,可用肉眼判定结果。

环境样品中病原性副溶血性弧菌高效检出法

〔目的〕为了提高环境样品中病原性副溶血性弧菌的检出率。〔方法〕采用PCR法、免疫磁珠法和神奈川现象培养基三者结合使用。〔结果〕分别从一份海水和一份海泥中检出了产生TDH ,神奈川现象阳性的副溶血性弧菌 ,血清型为O3 :K6。该血清型与同期发生的副溶血性弧菌食物中毒患者检出率最高的副溶血性弧菌血清型相同。经SfiⅠ ,NotⅠ限制性内切酶处理后 ,脉冲场凝胶电泳比较 ,一份海水与一名患者分离菌株、一份海泥与两名患者分离菌株的条带相同 ,表明为同一克隆派生而来。同时也说明食物中毒的发生与污染了TDH阳性O3:K6副溶血性弧菌的海水有关。〔结论〕该方法解决了用一般细菌培养分离方法很难从引起食物中毒的环境样品中检出病原性副溶血性弧菌的困扰 ,也为研究TDH阳性副溶血性弧菌在环境中的分布及由其引起的食物中毒的预防提供了重要依据。

副溶血性弧菌耐热性直接溶血素(TDH)的研究进展

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海产品中一种常见的食源性致病菌,常导致水产养殖动物患病或者引起食物中毒。耐热性直接溶血素(thermotolerant direct hemolysin,TDH)是副溶血性弧菌最为重要的致病因子之一。本文围绕tdh基因在弧菌属中的广泛分布与传播、tdh基因的多样性及其表达调控、TDH的蛋白结构及其生物活性进行了综述,并对未来TDH的研究方向进行了展望。旨在进一步了解由副溶血性弧菌感染所引起的病症,为预防副溶血性弧菌的感染和临床治疗提供理论支撑。

副溶血弧菌tdh基因LAMP检测技术的建立

环等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在等温条件下高特异性、高效、快速地扩增靶基因的DNA扩增技术。根据副溶血弧菌特异性的毒力基因tdh保守序列,本文设计1套特异性引物对该基因进行环等温扩增,同时对反应条件进行优化,建立携带tdh基因的致病性副溶血弧菌的LAMP快速检测技术。结果表明,LAMP最适反应在60.8℃恒温、45min内完成,与其它常见的细菌无交叉反应。LAMP方法的细菌DNA最低检出限为35.5fg/反应管,灵敏度较PCR方法高10倍。对扇贝样品中分离的菌株的检测表明,LAMP方法对检测致病性副溶血弧菌具有良好的可靠性。

海产品中溶藻弧菌的筛选及其致病因子的研究

溶藻弧菌能引起人类食物中毒。溶血毒素、耐热性肠毒素(ST)和不耐热性肠毒素(LT)是致病性微生物中常见的致病因子。本文对从扇贝、牡蛎、贻贝、沙虾、虾蛄等海产品中筛选的溶藻弧菌的种属和致病因子进行了研究,生化鉴定显示分离到的两株溶藻弧菌来源不同,基因测定显示它们同属于溶藻弧菌(V.alginolyticus);血琼脂平板法、兔小肠结扎法和乳鼠灌胃法显示来源不同的溶藻弧菌其产毒种类也不同,两株溶藻弧菌都能产生不耐热性肠毒素(LT)和耐热性肠毒素(ST),但只有1株能产生溶血毒素。

双重PCR检测副溶血性弧菌的tlh和tdh基因方法建立与初步应用

目的建立同时检测副溶血性弧菌的tlh和tdh基因的双重聚合酶链式反应(PCR)法。方法根据副溶血性弧菌的tlh、tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定稳定性、重复性、特异性及灵敏度。结果本实验设计的引物能特异性地扩增副溶血性弧菌的450、269 bp的片段,而对其它种类的菌物无特异性扩增,结果表明该方法特异性好,双重PCR检测灵敏度为100 cfu/ml。并进行了肛门拭子样品的检测。结论初步建立能在8 h内快速、灵敏、特异地检出副溶血性弧菌毒力菌株的双重PCR技术。