应用聚合酶链反应技术克隆猪源大肠杆菌耐热肠毒素基因

以质粒ＤＮＡ为模板，利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增和克隆了猪大肠杆菌耐热毒素基因ＤＮＡ片段；核苷酸序列分析表明。

猪大肠杆菌不耐热肠毒素基因的PCR检测

以产肠毒素性大肠埃希氏菌(ETEC)不耐热肠毒素(LT)保守序列为靶序列,设计合成了一对可扩增336 bp目的片段的引物,建立了检测ETEC不耐热肠毒素(LT)基因的PCR方法。该方法对987p+、鼠伤寒沙门氏杆菌、猪肺疫巴氏杆菌和链球菌的检测结果均为阴性。对15株分离自腹泻仔猪的待检菌株进行检测,有3株LT基因阳性。结果表明:该方法的特异性和敏感性较高,可用于ETEC的临床快速诊断和流行病学调查。

用PCR检测鸡大肠杆菌耐热肠毒素基因

用１对合成的特异性核苷酸片段，通过聚合酶链反应（ＰＣＲ），以鸡致病性大肠菌２０个血清型菌株提取的染色体为模板进行扩增，标准阳性对照（ｐＳＬＭ４００）及扩增到 １６个大小为 １５０ ｈｐ的 ＤＮＡ阳性片段，其它 ６株及阳性对照株 ｐＥＷＤ２９９未扩增到产物。斑点杂交表明，所扩增的阳性条带与标准耐热肠毒素基因（ ＳＴ）杂交后呈强阳性。

双重PCR检测猪产肠毒素性大肠埃希菌耐热肠毒素基因

为了研究猪产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC)耐热肠毒素基因(STa、STb)的临床快速诊断方法,试验以已发表的猪ETEC耐热肠毒素基因保守区为目的片段设计合成了2对可扩增182bp和108bp的引物,建立了检测ETEC耐热肠毒素基因的双重PCR检测方法。结果表明:该方法对猪肠出血性大肠埃希菌(EHEC)EDL933、猪链球菌、鼠伤寒沙门杆菌和猪肺疫巴氏杆菌的检测结果均为阴性;对11株分离自广东佛山地区腹泻仔猪的待检菌株进行检测,结果STa+5株、STb+2株,其中STa+STb+1株。

小肠结肠炎耶尔森菌耐热性肠毒素B基因(ystB)初步研究

目的研究小肠结肠炎耶尔森菌的耐热性肠毒素B基因(ystB)的分布特征。方法通过聚合酶链反应(PCR)、DNA探针杂交方法与序列分析检测致病性和非致病性小肠结肠炎耶尔森菌携带ystB基因的情况。结果98株非致病性小肠结肠炎耶尔森菌中52株携带ystB基因,占53.06%。全部48株致病性小肠结肠炎耶尔森菌均不携带该基因。结论ystB基因仅存在于部分生物1A型非致病性小肠结肠炎耶尔森菌,而不存在于致病性菌株中。

肠毒性大肠埃希菌肠毒素LTa基因特异性EMA-PCR检测方法的建立

由于传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,为避免因样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,本研究根据肠毒性大肠埃希菌(ETEC)不耐热肠毒素LTa基因设计特异性引物,利用叠氮溴乙锭(EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法。肠毒性大肠埃希菌CVCC196、CVCC197、CVCC200均能扩增出大小为438bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带。经EMA处理,除了完全死菌组外,含有10mL/L～1 000mL/L活菌的混合悬液均可扩增出目的片段。因此,成功建立了一种快速、有效的检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法,该方法较传统PCR大大提高了检测的准确性,灵敏度可达19cfu/mL。

猪大肠埃希菌肠毒素基因的多重PCR检测

以产肠毒素性大肠埃希菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)耐热肠毒素(STa、STb)基因和不耐热肠毒素(LT)基因保守序列为靶序列,设计合成了3对可扩增目的片段为182、108和336 bp的引物,建立了检测ETEC耐热肠毒素基因和不耐热肠毒素基因的多重PCR方法.该方法对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)EDL933、猪链球菌Streptcoccus、鼠伤寒沙门氏杆菌Salmonella typhimrium和猪肺疫巴氏杆菌Pasteurella pneumotropic的检测结果均为阴性,并且能检测到102cfu/mL稀释度的标准菌.对11株分离自广东佛山地区腹泻仔猪的待检菌株进行检测,结果为:含STa基因的菌株为5株;含STb基因为2株;含LT基因为3株,其中2株同时具有STb和LT基因.结果表明:该方法的特异性和敏感性较高,可用于ETEC的临床快速诊断和流行病学调查.

LAMP技术检测食品中产肠毒素大肠埃希氏菌

产肠毒素大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是一种重要的引起人畜共患病的致病菌,能引起水样便及酸中毒,建立快速、准确的检测方法对预防和控制产肠毒素大肠埃希氏菌的感染具有重要意义。基于ETEC不耐热肠毒素LT基因序列,设计LAMP引物检测产肠毒素大肠埃希氏菌。结果表明:LAMP检测产肠毒素大肠埃希氏菌的检出限为32.9cfu/mL,人工污染生猪肉的检出限为55cfu/g。LAMP将可以成为替代PCR的核酸扩增新技术,为快速检测产肠毒素大肠埃希氏菌构建了一个技术平台。

用非放射性标记 DNA 探针检测食品中沙门氏菌

核酸分子杂交技术是近十几年迅速发展起来的。即利用核苷酸碱基顺序互补原理,用特异的DNA 探针,通过核酸杂交和鉴定和检测样品中的微生物。自八十年代以来,由于制备探针方法上的突破,显著提高了其检测的敏感性及特异性。Hill