产耐热蛋白酶乳酸菌的筛选、产酶条件及其酶学性质的研究

从内蒙古部分传统发酵乳样品以及酸菜汤中分离到105株乳酸菌,用检测蛋白酶产生水解圈和福林酚蛋白酶活性测定相结合的方法,从中筛选出一株耐热蛋白酶产生菌株WH29-3-1,该菌株经初步鉴定为Enterococcus faecium。同时,对其产酶条件及酶学性质进行研究。结果表明,菌株WH29-3-1是在以葡萄糖为碳源、蛋白胨+牛肉膏+酵母粉为氮源、碳氮比为0.8、pH7.0的最适产酶培养基中45℃、接种量为4%的条件下发酵培养30h,具有最大产酶量13.13U/ml,且K2HPO4、MgSO4有促进蛋白酶产生的作用。由菌株WH29-3-1产生的耐热蛋白酶的最适作用pH值为7,最适作用温度为50℃。结果表明,该菌是一株具有进一步改造利用价值的产蛋白酶菌株。

嗜热脂肪芽孢杆菌中耐热蛋白酶基因的克隆

用鸟枪法把嗜热脂肪芽孢杆菌313-1(供体菌)染色体上的蛋白酶基因克隆到质粒pPL603上,并在枯草杆菌中得到表达。此基因位于6.6kb的EcoRI酶切片段上,带有重组质粒的枯草杆菌所产生的蛋白酶活性比供体菌株约提高30倍左右。该酶的最适反应温度为75℃,最适pH为7.0左右,是一个中性蛋白酶,在80℃作用30min后仍保留85%以上的酶活。

耐热蛋白酶对UHT乳蛋白的水解作用

采用SDS-PAGE、Urea-PAGE分析耐热蛋白酶对UHT乳蛋白的水解作用。结果表明:荧光假单胞菌(PF)蛋白酶和纤溶酶(PL)作用底物不同,产物也不同;前者优先水解κ-酪蛋白生成副κ-酪蛋白,而PL主要水解β-酪蛋白与α-酪蛋白生成γ-酪蛋白及胨、肽等。分别经PL和细菌蛋白酶水解3h的UHT乳水解产物,在pH4.6和12g/100mL三氯乙酸(TCA)沉淀后经反相高效液相色潽仪(RP-HPLC)分析滤液,两者呈现不同的色谱图。

耐热蛋白酶对UHT乳品质的影响及控制方法研究进展

从耐热蛋白酶对UHT乳品质的影响的角度出发,对近几年来国内外在牛乳中主要耐热蛋白酶的来源、检测方法、酶对UHT乳蛋白质水解和凝胶的影响、控制方法等方面的研究进展情况进行了综述,并提出今后深入研究应关注的方向和重点。

原料乳耐热蛋白酶对UHT乳品质的影响

据统计，2007年全国736家规模以上（含国有企业和年产品销售收入在500万元以上非国有企业）乳制品企业共实现工业产值1329．01亿元，年产量也从2000年的919万t发展到2007年的3650万t，2007年全国规模以上乳制品企业共生产乳制品（包括液态奶和干乳制品）1787．44万t，其中，液态奶1441．00万t，干乳制品346．45万t。

产耐热蛋白酶苏云金芽胞杆菌的发酵动力学

对苏云金芽胞杆菌FZ62耐热蛋白酶的代谢过程进行初步研究,酶生成与菌体生长为耦联过程。以Logistic方程和Luedeking-Piret方程为基础,建立该菌发酵过程中菌体生长、产物生成和基质消耗的动力学模型,求得模型参数,该动力学模型与试验结果拟和程度较好。

耐热中性蛋白酶产生条件及酶的亲和层析纯化

从云南西双版纳分离的耐热菌株中筛选到菌号为HY-69的菌株,经鉴定为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus).该菌产中性蛋白酶.对该菌株的产酶条件进行了研究,酶的产量和耐热性均优于其它菌株.发酵液经超滤浓缩、硫酸铵沉淀后以亲和层析纯化.粗酶分别以Cbz-L-phe-T-sepharose 4B和Cbz-D-phe-T-sepharose 4B纯化,并对两种材料的纯化效果进行了比较,得到了PAGE和SDS-PAGE均一的酶.

一株嗜热芽孢杆菌产生的耐热蛋白酶的研究

从新疆荒漠地区分离到一株嗜热芽孢杆菌 ,该菌生长温度范围为 2 5～ 5 7℃ ,最适生长温度为 4 5℃ ,能产生耐热中性蛋白酶。经测定 ,酶的最适反应温度为 6 5℃ ,5 5℃处理 1h酶活无任何损失。酶的作用pH范围为 5 .0～ 9.0 ,pH稳定范围 7.0～ 8.5。野生菌在 1 1 0r/min ,4 5℃下培养 6 0h ,发酵液产酶为 5 0 0 0单位 /mL。

产耐热蛋白酶菌株的分离和酶性质的研究

从南汇县黄路乡一草堆下的土壤中分离到一株产耐热蛋白酶的链霉菌.该酶的最适反应温度为70℃.在60℃时稳定,当80℃时处理10min,尚余84%活性.在Ca^(2+)存在的条件下,酶的热稳定性有显著提高.酶反应的最适pH为8.5,在pH5～9之间稳定,因此属于微碱性蛋白酶.通过抑制剂试验,该酶基本上被PMSF(苯甲基磺酰化合物)抑制,但不被金属螯合剂(EDTA,双吡啶)抑制.金属离子Cu^(2+),Zn^(2+),Fe^(2+)和Co^(2+)对酶有抑制作用,Ca^(2+)对酶有激活作用.

尖孢镰刀菌M1耐热蛋白酶纯化及酶学性质

【背景】前期工作中,从北大仓白酒大曲分离到一株真菌,经形态学和分子生物学方法,将其鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporim)M1,研究发现该菌能产中性蛋白酶。中性蛋白酶是应用于工业化生产的重要酶制剂。由于其作用条件温和、催化速率较高,被广泛应用于食品、医药、皮革、饲料、化工和废弃物处理行业。【目的】为了使该菌蛋白酶应用于相关工业生产,需要对该蛋白酶进行纯化和酶学特性研究。【方法】采用硫酸铵分级分离、疏水和离子交换层析对该菌蛋白酶进行纯化,通过SDS-PAGE测定酶的纯度和分子量,并研究其热稳定性和酸碱适应性。【结果】经各步层析,蛋白酶纯化倍数达26.1,得率为7.9%;经测定纯酶的分子量为62 kD;该酶最适温度为40℃,最适pH为7.0,属于中性蛋白酶;该酶对酸较敏感,对碱有较强的耐受性;耐热性较强,但酶活性不受乙二胺四乙酸二钠盐抑制。【结论】由于该中性蛋白酶具有较好的耐热性,因此,可作为工业生产上潜在的生物催化剂。

嗜热脂肪芽孢杆菌HY-69耐热金属蛋白酶基因表达产物的纯化及性质研究

利用ＣＭ纤维素离子交换层析法，从宿主细胞枯草芽孢杆菌ＭＩ１１３中纯化了嗜热脂肪芽孢杆菌ＨＹ６９的耐热金属蛋白酶基因的表达产物，达电泳纯。该酶的最适反应温度为７０℃，有着较好的热稳定性和极高的盐酸胍抗性。７０℃的半寿期为４５ｍｉｎ。在３ｍｏｌ／Ｌ的盐酸胍中变性２０ｍｉｎ，仍残余近４０％的酶活。利用凝胶过滤和ＳＤＳＰＡＧＥ，测定其分子量均为２７０００±１０００。通过ＣＤ光谱得知，该酶含有６６％的α螺旋，２８％的β转角，６％的无规则卷曲，无β折叠。利用ＣＤ光谱和荧光光谱研究了该酶在盐酸胍变性过程中的构象变化，推测其主要是通过增加包装效率，减少无规则卷曲来提高酶的稳定性。

耐热碱性蛋白酶的纯化及其主要性质研究

由我国新疆沙漠土样中分离获得的栗褐芽胞杆菌 CPU 94 0 7(Bacilus Badium CPU94 0 7) ,能产生耐热碱性蛋白酶 ,以葡萄糖 1.0 % ,蛋白胨 0 .5% ,酵母膏 0 .5% ,Mg SO4 0 .0 2 5%为培养基 ,在 p H9.3,37℃振荡培养 4 8h,发酵液酶活力为 5796u/ml。粗酶经 (NH4 ) 2 SO4 分级沉淀 ,DEAE- C(DE- 32 )两次层析 ,Sephadex G- 10 0层析 ,得到 SDS- PAGE电泳均一样品 ,比活 4 0 50 u/mg,是粗酶比活的 9倍。该酶的分子量为 2 7.5k D,最适 p H为 9.6,最适温度为 57℃ ,Cu2 +与 Ag+对其活力有明显抑制作用 ,在 50℃处理 1h后酶活力基本不变 ,50℃处理 3h后 ,酶活力降到原来的56%。

耐热丝氨酸蛋白酶改性大豆分离蛋白分散性条件研究

利用耐热丝氨酸蛋白酶对大豆分离蛋白进行改性,提高其分散性。采用响应面实验设计,以加酶量、底物浓度、pH值和酶解温度为实验因素,以分散度指标为响应值,建立数学模型,优化酶解工艺参数。结果表明:最佳的酶解条件为:加酶量为4 070 U·g-1、底物浓度6.0%、反应温度71℃、pH 9.0,该条件下得到改性大豆分离蛋白的分散度为12.78,与未改性大豆分离蛋白分散度相比提高了2.09倍。

耐热性蛋白酶对乳品质影响的研究进展

论述了嗜冷菌蛋白酶的耐热机制及其所引起的UHT乳的胶凝性质,提出了控制耐热性蛋白酶活性的措施。

荧光假单胞杆菌胞外蛋白酶的纯化及热稳定性

从原料乳中分离获得一株荧光假单胞菌Rm12,该菌株分泌的胞外蛋白酶具有很强的耐热性,其发酵上清液经过硫酸铵沉淀、阴离子层析、疏水层析和分子排阻层析纯化得到SDS-PAGE均一蛋白酶,经鉴定确认该酶是一种新的金属蛋白酶,命名为Ht12,对Ht12的基本特性和热稳定性进行了研究.结果表明,此蛋白酶分子量为45000,含有较高的脯氨酸和二硫键,N末端氨基酸残基序列为MSKVKDKAIVSAAQAS,Mn2+对蛋白酶活力有促进作用.该蛋白酶具有较高的热稳定性,于160℃加热20s,保留活力3.8%.

原料乳中产耐高温蛋白酶菌株的筛选与鉴定

从原料乳中分离筛选产耐高温蛋白酶菌株,经酪蛋白水解圈实验,筛选出10株产蛋白酶的菌株。在此基础上,通过蛋白酶耐热性比较,筛选出一株产耐高温蛋白酶菌株,并通过菌落形态观察、生理生化试验、核酸特征分析及16S rRNA基因序列测定等对该菌株进行鉴定。BLAST比对构建该菌株系统发育树,最终鉴定该菌株为荧光假单孢杆菌。

嗜冷菌耐热性胞外蛋白酶对液态奶的影响

嗜冷菌产生的耐热性胞外蛋白酶是引起乳及乳制品多种缺陷的主要原因之一。大多数嗜冷菌产生的胞外蛋白酶属于碱性金属蛋白酶,对热处理具有非常高的稳定性,最适的温度和pH分别在30-40℃和6-8。嗜冷菌胞外耐热性蛋白酶耐热的机理在于经过高温处理后,未被破坏的处于非折叠状态的蛋白酶分子在冷却过程中重新折叠成有活性的天然构象,因此,生奶中一旦产生此类蛋白酶后,无法通过单一的热处理完全灭活。作为一种嗜冷菌污染的更具代表性的指征,此类蛋白酶可以利用FITC-干酪素来检测其活力,达到有效控制生奶及其它乳制品质量的目的。

耐热嗜碱蛋白酶基因的克隆、表达及其酶学性质分析

碱性蛋白酶是一类重要的工业酶制剂。为进一步提高碱性蛋白酶在高温碱性条件下的活力,增强其工业应用价值,本文从地衣芽胞杆菌CCTCC M2018539中首先通过PCR扩增获得碱性蛋白酶编码基因aprE539并克隆入表达载体pND-113中,在枯草芽胞杆菌WB600中实现碱性蛋白酶AprE539的表达;重组酶AprE539经硫酸铵沉降(30%~70%)、透析、DEAE阴离子交换和超滤获得纯酶,并以SDS-PAGE电泳测定AprE539的分子量大小。结果表明,AprE539的分子量大小为30 kDa。进一步对其酶学性质研究表明:AprE539的最适作用pH为11.0,最适作用温度为65~70℃;在pH6.0~12.0范围内具有较好的稳定性;在60℃保温1 h后酶活剩余70%;Cu^2+、Mn^2+、Ca^2+和Mg^2+对酶活有明显促进作用。AprE539在氨基酸序列上仅有2个氨基酸残基与碱性蛋白酶2709存在差异,但其酶学特征差异明显,为后续进一步探究其酶学性质差异性奠定基础。

耐高温中性蛋白酶产生菌株KN1的部分酶学性质及发酵条件的研究

为了给酶的应用提供理论依据,采用Folin-酚法测定蛋白酶活性,通过单一变量控制对KN1菌株的蛋白酶酶学特性和发酵条件进行研究。该酶的最适作用温度为75℃,最适作用pH7.5,Cu^(2+)对酶活有促进作用;EDTA对酶活有明显的抑制作用,而PMSF对酶活的抑制作用小,推测KN1菌株产生的是一种金属蛋白酶;经SDS处理后KN1的蛋白酶仍能保持较高的活性。KN1菌株的蛋白酶的最佳发酵条件为37℃培养4天,最佳碳源为玉米粉,最佳氮源为豆饼粉。KN1菌株的蛋白酶是一种耐高温中性蛋白酶,最适作用温度达到75℃,在最适合条件下,酶活性可达1498.84U/mL,具有良好的应用前景。

耐热碱性蛋白酶AH-101的异源表达、酶学性质与洗涤应用研究

目的:通过NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库筛选可以应用于洗涤工业的蛋白酶,使用地衣芽孢杆菌进行高效表达。方法:利用同源重组的方式将蛋白酶基因整合到地衣芽孢杆菌基因组中,研究重组蛋白酶的酶学特性和洗涤效果。结果:该重组酶的最适作用温度为60℃,最适pH为11.0;AH-101具有良好的耐热性,可以在20~55℃范围内保持稳定,在60℃保温1 h,剩余活性仍高于30%;此外,该酶与表面活性剂和液体洗涤剂具有良好的兼容性,在终浓度为0.1%和0.5%的表面活性剂和液体洗涤剂中孵育2 h,重组酶的酶活力损失小于30%。结论:成功构建了一株含有外源蛋白酶的地衣芽孢杆菌重组菌株,对重组蛋白酶的特性和洗涤效果进行研究,该重组蛋白酶可以作为环保型酶制剂应用到洗涤工业中。