编码耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶的pheB基因在大肠杆菌中的亚克隆与高表达

目的：构建ｐｈｅＢ基因高表达菌株，研究酶的耐热机制。方法与结果：通过ＰＣＲ扩增方法，对位于质粒ｐＦＤＡ１３上的ｐｈｅＢ基因进行扩增，克隆于ｐＵＣ１１８Ｎ和ｐＵＣ１１９Ｎ上，经双向测序，证明ＰＣＲ过程中并未发生突变，然后亚克隆于高表达载体ｐＪＬＡ５０３，转化Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１，经４２℃诱导，获得了高表达的基因产物，表达量占细菌总蛋白的３４．６％。并与ｘｙｌＥ基因编码的邻苯二酚２，３双加氧酶作了耐热性比较。结论：ｐｈｅＢ基因在大肠杆菌中获得了高表达，高表达后重组酶的耐热性未发生改变。

点突变Pro229Ser和Glu243Gly对耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶性质的影响

采用ＰＣＲ随机诱变方法，研究氨基酸置换对耐热邻苯二酚２，３－双加氧酶性质的影响。 比较分析了突变体Ｐｒｏ２２９Ｓｅｒ和Ｇｌｕ２４３Ｇｌｙ与野生型酶的酶学性质。结果显示点突变 Ｐｒｏ２２９→Ｓｅｒ或Ｇｌｕ２４３→Ｇｌｙ并未改变酶的最适反应温度（均为６０℃）；突变体Ｐｒｏ２２９Ｓｅｒ （Ｋｃａｔ／Ｋｍ＝ ４．８９ ± ０．０１ × １０６ｍｏｌ－１ｓ－１）以及突变体 Ｇｌｕ２４３Ｇｌｙ（Ｋｃａｔ／Ｋｍ＝ ５． ８８±０． ０１× １０６ｍｏｌ－１ｓ－１）的催化能力与野生型酶（Ｋｃａｔ／Ｋｍ＝６．９７±０．０１× １０６ｍｏｌ－１ｓ－１）相比有所下 降；点突变Ｐｒｏ２２９→Ｓｅｒ大幅度降低了酶的热稳定性（△Ｔｍ≈ １０．２℃），而点突变Ｇｌｕ２４３－Ｇｌｙ 对酶的热稳定性影响较小（△Ｔｍ≈１．５℃）。推测Ｐｒｏ２２９对耐热邻苯二酚２，３－双加氧酶的热稳 定性有重要贡献。

应用多波长反常散射法测定耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶的晶体结构

运用基因工程技术,将耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶（TC23O）分子中的甲硫氨酸（Met）全部置换为甲硒氨酸（SeMet）.培养出甲硒氨酸置换的耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶（SeMet-TC23O）的晶体.利用同步辐射光源收集了SeMet-TC23O 晶体的X射线衍射数据,应用多波长反常散射方法测定了TC23O0.3mm的晶体结构.结果显示,TC23O分子为同源四聚体结构,每个单体由相对独立的N-端结构域（1～153位氨基酸残基）和C-端结构域（153～319位氨基酸残基）构成.每个结构域含有两个在此类酶中具有特征性的βαβββ结构花样.两个结构域可根据分子内非晶体学对称轴近似叠合.