过表达谷子SiANT1对水稻耐盐性的影响

【目的】高盐胁迫是影响作物产量的主要因素之一,谷子(Setaria italica L.)具有耐逆性强的特点,从谷子中筛选耐盐基因对于利用基因工程的手段培育耐盐作物新品种具有重要意义。【方法】分析谷子AP2/ERF类转录因子类基因SiANT1在豫谷一号幼苗期在高盐、低氮、PEG模拟干旱处理条件下的表达模式;进而利用农杆菌转化法将SiANT1转入模式作物水稻品种Kitaake;分别用0.9%盐水和自来水浸泡过表达SiANT1水稻和野生型Kitaake的种子,观察其萌芽期的表型并统计发芽率;用含0.9%Na Cl的Hogland营养液室内处理水稻幼苗10 d,65℃烘48 h之后称量干重;同时将其种植在大田,在水稻孕穗前用0.9%盐水灌溉一次,统计成熟后过表达SiANT1水稻各株系和野生型的单株籽粒重、株高、单株分蘖数,对其耐盐性进行评价;利用定量Real time-PCR方法,验证分析转基因水稻株系中SiANT1及其可能的下游基因的相对表达情况。【结果】谷子SiANT1蛋白(XP004985124.1,SiANT1)属于AP2亚族,与高粱(XP021318293.1,Sb ANT1)和玉米(XP008658933.1,Zm AP2)亲缘关系较近;豫谷一号中SiANT1的表达受高盐胁迫(100 mmol·L-1 Na Cl)诱导;将SiANT1和LP0471118-Bar-ubi-EDLL载体连接,利用农杆菌转化法将SiANT1转入到水稻基因组中,筛选得阳性T0植株,繁殖两代得T3代种子;自来水浸泡下,过表达SiANT1水稻种子萌发率和野生型相差不大,萌芽率为90%以上;0.9%盐水浸泡下,过表达SiANT1水稻种子萌发明显受到抑制,与野生型相比,过表达SiANT1水稻种子露白推迟,但最终(处理120 h)萌芽率达到80%以上;室内水稻苗期用0.9%Na Cl处理后,过表达SiANT1水稻的单株干重较受体Kitaake增重14.11%—37.42%,在1%水平上呈显著差异;大田水稻成熟后过表达SiANT1株系单株籽粒重较受体Kitaake增产56.12%—76.58%,在5%水平上呈显著差异,单株分蘖数增多、株高增加,但与野生型无显著差异;半定量RT-PCR分析表明,过表达SiANT1的3个水稻株系都在RNA水平上表达SiANT1;定量Real time-PCR结果表明,过表达SiANT1的3个水稻株系间SiANT1的相对表达量有所差异,但较受体而言,都极显著增加,并且其内源耐盐相关基因Os SOS1和Os ZFP182的相对表达量分别较受体提高1.1—1.7倍和1.6—2.3倍。【结论】Os SOS1和Os ZFP182是耐盐相关基因已被证实,SiANT1具有一定的耐盐性,过表达SiANT1水稻可能是通过增加下游基因Os SOS1和Os ZFP182的表达从而提高耐盐性。

盐胁迫下小麦体细胞杂种与亲本小麦幼苗的生长量和Na^+、K^+含量比较

对小麦体细胞杂种F6株系Ⅰ-1-3和其亲本小麦济南177的幼苗在不同NaCl浓度处理6d时的生长量和Na+、K+含量进行了比较。结果表明:盐胁迫下杂种的生长量明显高于亲本小麦。随着盐浓度的增加,杂种和亲本的叶、茎和根中Na+含量均增加,但杂种叶与茎的Na+含量显著低于亲本,而根的却高于亲本,这可能提示杂种根部液泡较亲本有较强的储Na+功能。受盐胁迫的杂种叶与茎中K+含量显著高于亲本,K+/Na+比值高。杂种的Na+净积累速率也高于亲本。可见杂种比亲本小麦有更强的耐盐性。

有色大麦种质芽期耐盐性鉴定

以44份有色大麦种质为试材,通过测定发芽势、发芽率、发芽指数、萌发活力指数结合两个颜色指标YU(颜色亮度和浓度)进行芽期的耐盐性鉴定,并运用相关性分析、主成分分析、聚类分析等方法对有色大麦材料进行多指标耐盐性综合评价。结果表明,发芽率和发芽指数对盐胁迫响应最为敏感,芽长和根长对盐胁迫响应较为迟钝;粒色亮度与耐盐性综合评价F值呈显著负相关;粒色浓度与耐盐性综合评价F值呈显著正相关;综合指标F值相关分析表明,颜色越深,耐盐性越强;用综合指标F值,可将44份有色大麦分为4类,其中强耐盐材料包括XZDM-1401、XZDM-1404、XZDM-1543、XZDM-1546等4份,中等耐盐性包括XZDM-926、XZDM-957、XZDM-972等16份,弱耐盐性包括XZDM-815、XZDM-1606、XZDM-1030等12份,敏盐性包括XZDM-973、XZDM-1042、XZDM-1318等12份。

微生物肥料新型功能作用机理与根际定殖增强策略

微生物肥料是支撑农业绿色发展的重要投入品,根际益生菌是微生物肥料菌种的主要来源。我国农业发展对促进作物根系发育、增强作物耐盐胁迫能力等新型功能的微生物肥料提出了需求,然而目前对根际益生菌促进作物根系发育和增强耐盐胁迫的分子机理研究仍然薄弱,成为制约优异菌种选育的瓶颈。另一方面,微生物肥料的根际定殖能力低也是导致其田间应用效果差的重要因素。本文综述了根际益生菌调控根系发育、增强植物耐盐的活性物质和作用机理,分析其根际定殖的过程和菌植互作机制,提出了增强根际定殖的策略,以期为微生物肥料研究提供参考。

谷子转录因子基因SibZIP42在拟南芥中对高盐和ABA的响应

【目的】分析谷子抗逆相关转录因子基因Sib ZIP42的特性和生物学功能,探讨Sib ZIP42提高植物耐盐性的调控途径,为作物抗逆分子育种提供新的候选基因。【方法】利用生物信息学方法分析谷子Sib ZIP42的特性:使用Clustal X 2.0和MEGA 5.05软件对谷子Sib ZIP42蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建系统进化树;从数据库Phytozome获取谷子Sib ZIP42上游2 000 bp作为启动子序列,在PLACE数据库对Sib ZIP42启动子顺式作用元件进行分析;使用Net Phos 2.0 Server数据库预测Sib ZIP42蛋白磷酸化位点;利用实时荧光定量PCR检测Sib ZIP42在不同胁迫条件下的表达模式;将Sib ZIP42与绿色荧光蛋白GFP融合表达,检测Sib ZIP42蛋白的亚细胞定位情况;构建植物表达载体p BI121-Sib ZIP42,转化拟南芥并检测转Sib ZIP42拟南芥的耐盐性及对ABA处理的敏感性。分析转Sib ZIP42拟南芥中ABA及脱水响应相关基因表达变化,分析Sib ZIP42调控植物耐盐性的作用机制。【结果】谷子Sib ZIP42全长546 bp,编码由181个氨基酸组成的亲水性蛋白,分子量约为20.3k D,基因编码区包含1个外显子;系统进化树分析表明该基因位于b ZIP基因家族的S亚组;Sib ZIP42与拟南芥Atb ZIP42序列同源性最高;启动子元件分析表明,Sib ZIP42包含ABRE、MYB、MYC等多种逆境胁迫应答相关元件;磷酸化位点分析结果显示Sib ZIP42含有14个丝氨酸、4个酪氨酸和1个苏氨酸磷酸化位点;实时荧光定量PCR结果显示,Sib ZIP42对多种非生物胁迫均有不同程度的响应,在高盐、干旱(PEG)和ABA处理条件下表达量明显上升,Sib ZIP42在根部的表达量显著高于在茎及叶子中的表达;亚细胞定位结果表明,Sib ZIP42蛋白定位于细胞核中;基因功能分析结果显示,在正常MS培养基上,野生型拟南芥WT和Sib ZIP42转基因拟南芥的萌发率基本一致,在Na Cl浓度为90、120和150 mmol·L^(-1)的MS培养基上,转基因拟南芥萌发率显著高于WT,在90 mmol·L^(-1) Na Cl处理条件下,转基因拟南芥的绿化率显著高于WT;在ABA浓度为0.5、1和2μmol·L^(-1)的MS培养基上,转基因拟南芥的绿化率显著低于WT;下游基因检测结果表明,HIS1-3、RD29B和RAB18等ABA胁迫响应相关基因以及脱水响应相关基因At PIP2A在转基因植株中表达量显著高于在WT中的表达,表明Sib ZIP42可能通过ABA信号途径提高植物对高盐胁迫的耐性。【结论】与WT相比,Sib ZIP42转基因拟南芥株系在种子萌发时期耐盐性显著提高。同时,在种子萌发后期Sib ZIP42转基因株系相比于WT对ABA处理的敏感性增强,Sib ZIP42可能通过ABA信号途径正向调控植物的耐盐性。

棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的克隆及表达分析

【目的】克隆棉花精氨琥珀酸合成酶基因Gh ASS1的c DNA序列,并利用原核表达系统高效表达融合蛋白,检测融合蛋白的精氨琥珀酸合成酶活性及其表达对工程菌生长、耐盐能力及与游离L-瓜氨酸(L-Cit)和L-精氨酸(L-Arg)含量的影响,为解析该基因的功能及作用机制奠定基础。【方法】以拟南芥推断的精氨琥珀酸合成酶c DNA序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花幼叶中获得c DNA片段,T/A克隆测序后得其序列信息,利用生物信息学软件分析其DNA结构、蛋白质结构、功能域和同源性,并构建系统进化树。利用q RT-PCR检测其在盐胁迫下的表达模式;将Gh ASS1的开放阅读框连接到原核表达载体p Cold-TF上,构建融合表达载体p Cold-Gh ASS1,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)plys S中进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE法测定表达产物分子量,焦磷酸荧光法测定酶活性和比活力,HPLC法测定工程菌中L-Cit和L-Arg的含量,对比不同温度和不同Na Cl浓度下工程菌与对照菌的生长速度及其体内L-Cit、L-Arg含量及L-Arg/L-Cit。【结果】棉花Gh ASS1存在于D基因组的第1染色体上,由10个外显子和9个内含子构成,其c DNA全长序列共1 584 bp,其中5′非翻译区22 bp,开放阅读框1 485 bp,3′端非翻译区77 bp,编码产物由494个氨基酸组成,推断分子量为54 k D,等电点6.74;序列比对分析表明Gh ASS1与大肠杆菌、酵母和拟南芥中同源蛋白序列一致性分别为21.81%、41.1%和78.5%,且具有典型的精氨琥珀酸合成酶结构模序;系统进化分析显示Gh ASS1与番茄、马铃薯和烟草中同源蛋白亲缘关系最近,而与云杉、卷柏中同源蛋白亲缘关系最远;盐胁迫可上调叶片中Gh ASS1的表达,1 d时达到峰值,随后逐渐下降,推测Gh ASS1参与棉花对盐胁迫的早期响应。表达载体p Cold-Gh ASS1在工程菌中表达的融合蛋白分子量约108 k D,与预期相符,在体外具有精氨琥珀酸合成酶活性;与对照菌相比,p Cold-Gh ASS1工程菌中游离L-Cit含量下降,L-Arg含量上升,且在生长周期中较快进入对数生长期;在含高浓度Na Cl的培养基中p Cold-Gh ASS1工程菌表现出更强的生长活力和较高的L-Arg/L-Cit值,显示了其具有较强的L-Cit向L-Arg的代谢流。【结论】从棉花中克隆了植物精氨琥珀酸合成酶基因c DNA序列Gh ASS1,推测其在植物体内可参与植物的生长和耐盐能力的调控。