三类禽源碳青霉烯类耐药大肠杆菌流行病学调查及全基因组测序分析

【目的】研究不同禽源碳青霉烯类耐药大肠杆菌(carbapenem-resistant Escherichia coli,CREC)的群间分布、耐药特征及菌株间亲缘关系,为阻断CREC的潜在危害提供技术支持。【方法】在胶东地区采集肉鸡、蛋鸡、水禽三类家禽泄殖腔拭子1131份,利用选择性分离培养、质谱鉴定、PCR、微量肉汤稀释法、多位点序列分型(MLST)及全基因组测序(WGS)等方法进行CREC菌株鉴定与分析。【结果】共分离出364株bla NDM基因阳性的CREC菌株,分离率为32.18%,阳性场总体占比为76.32%,肉鸡场和个体阳性率均最高,分别为93.33%和55.56%。三类禽源菌株均多重耐药,83.65%菌株对8类及以上药物同时耐药,对多数测试药物耐药率在80%以上。肉鸡多重耐药问题最严重,水禽次之,蛋鸡相对较轻。45株全基因组测序的CREC菌株携带12类52种耐药基因,4种bla NDM变异体,以bla NDM-5(77.78%)为主,三类家禽对同类耐药基因的检出率存在差异。共检出46种ST型,多样性比为44.23%。三类家禽CREC菌株间单核苷酸多态性(SNPs)差异位点为82~71307个,且携带的优势型不同。【结论】携带bla NDM的CREC在不同家禽养殖场尤其是肉鸡场广泛存在,以bla NDM-5亚型最为常见,对多种抗菌药普遍耐药,且携带大量耐药基因,以质粒传播为主。CREC菌株在三类家禽中呈多样化分布,且多数菌株间亲缘关系相差较远。提示应针对不同动物群体,加强监测和影响因素研究,以降低CREC的潜在风险。

五倍子水提液与抗生素联合对耐药大肠杆菌的抗菌作用研究

为探讨五倍子水提液(Galla chinensis extract,GCE)与临床常用抗生素联用对耐药大肠杆菌(E.coli)的体内外抑制效果,试验采用微量肉汤稀释法检测GCE和不同抗生素联用对临床分离E.coli的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC);采用棋盘稀释法进行联合药敏试验,计算GCE和抗生素联用时的分级抑菌浓度(fractional inhibitory concentration,FIC),判定药物间的相互作用;采用E.coli感染模型小鼠进一步验证GCE与抗生素联合应用的体内效果。结果表明:GCE对E.coli标准菌株和多重耐药菌株均有明显的抑制作用,MIC范围为4~8 mg/mL;GCE与β-内酰胺类抗生素联合的FIC小于0.5,表现为协同抑菌作用;在E.coli耐药菌株(MC02)动物感染模型中,与单独用药相比,GCE与阿莫西林联合可明显提高感染小鼠的存活率和增重,并减轻肠道病变。提示GCE可增强β-内酰胺类抗生素对耐药菌的抑制作用。

北京温榆河流域耐药大肠杆菌的调查研究

采用滤膜法结合大肠杆菌显色培养基，调查了北京地区温榆河流域氨苄青霉素、四环素、磺胺（磺胺甲厄唑-甲氧苄啶联用）和左旋氧氟沙星4类抗生素耐药大肠杆菌的发生情况，结果表明，温榆河流域总大肠杆菌数为10^3—10^7个／L，耐药大肠杆菌数为0-10^6个，L；大肠杆菌对氨苄青霉素、四环素和磺胺耐药率分别为10％～35％、5％～25％、10％～35％，而使用时间最短的左氧氟沙星耐药率则低于15％；受渔场排放影响的采样点，四环素耐药大肠杆菌数量显著高于该点其他抗生素耐药大肠杆菌数量，而左氧氟沙星耐药大肠杆菌数量百分比相对较高的采样点推测可能源于人类排放．

赤芍水提物与抗菌药联合对耐药大肠杆菌抑菌作用的研究

为了探究赤芍水提物与抗菌药联合对耐药大肠杆菌的体外抑菌作用,采用微量肉汤稀释法与微量棋盘法来测定各抗菌药与赤芍水提物的最低抑菌浓度(MIC)及二者联合作用后的分级抑菌浓度指数(FICI)。结果显示赤芍水提物与头孢曲松钠、阿莫西林、环丙沙星、诺氟沙星、左旋氧氟沙星、磷霉素、痢菌净、克林沙星、磺胺间甲氧嘧啶、加替沙星、阿米卡星、头孢他啶、林可霉素、头孢噻呋钠、氟苯尼考、阿奇霉素、头孢噻肟、利福平联合作用后的FICI分别为0.27、2.50、1.02、1.01、3.00、0.28、1.02、1.02、1.02、2.02、1.02、0.75、0.56、0.75、0.50、3.00、0.75、0.38。结果表明赤芍水提物与头孢曲松钠、磷霉素、氟苯尼考、利福平联合作用时有协同作用;与林可霉素、头孢噻呋钠、头孢噻肟、头孢他啶联合作用时有相加作用;与阿莫西林、左旋氧氟沙星、加替沙星、阿奇霉素联合作用时有颉颃作用;与环丙沙星、诺氟沙星、痢菌净、克林沙星、磺胺间甲氧嘧啶、阿米卡星联合作用时表现为无关作用。

实时荧光定量PCR检测多重耐药大肠杆菌AcrA基因mRNA表达水平

体外单一药物诱导标准大肠杆菌ATCC25922,获得了耐氯霉素(CHL,MIC≥256 mg/L)、耐环丙沙星(CIP,MIC≥256 mg/L)、耐水杨酸钠(SAL,MIC≥275 mg/L)、耐四环素(T,MIC≥512 mg/L)的菌株。选取ATCC25922株,4株中度耐药菌SAL(175)、CHL(64)、T(64)、CIP(128),4株高度耐药菌SAL(275)、CHL(256)、T(512)、CIP(256),和临床分离的3株耐药大肠杆菌H1、H9、H10,通过实时荧光定量RT-PCR方法检测外输泵AcrA基因的mRNA表达水平。系统自动分析软件显示,Ct值与标准质粒浓度的对数之间存在良好的线性关系,回归系数为0.992。检测结果表明:H10、CHL(256)、CIP(256)拷贝数最高,达1015拷贝/μL;T(512)、H9、T(128)、SAL(275)、H1为1014拷贝/μL;CHL(128)、T(64)、CHL(64)为1013拷贝/μL;ATCC25922为1012拷贝/μL。不同程度耐药株AcrA基因的表达量不同,临床分离株和诱导的各高耐药菌株均比ATCC25922株表达量高,且差异极显著(P≤0.01)。这说明不同耐药程度的11株菌cDNA的量存在差异,AcrA基因转录水平与耐药水平成正相关。

动物源性多重耐药大肠杆菌的分离与鉴定

近几年来，大肠杆菌病给畜牧业造成的经济损失日趋严重，致病性大肠杆菌已经成为医学和动物医学临床感染中最常见的病原菌之一。临床上主要表现为脐炎、关节炎、腹膜炎、输卵管炎、眼球炎、败血症。每年死亡的幼猪中约有50％与产毒性大肠杆菌有关，20世纪40年代以来，随着百余种抗菌药物的广泛使用，细菌对抗菌药物耐药已成为当今时代的一个特征。

氧氟沙星和托氟沙星在氟喹诺酮耐药大肠杆菌中的蓄积研究

目的:研究大肠杆菌耐药菌株蓄积亲水性氟喹诺酮药物氧氟沙星和疏水性药物托氟沙星的机制有无差异.

哈尔滨地区猪源多重耐药大肠杆菌接合性质粒和整合子检测

为调查哈尔滨周边地区猪源多重耐药大肠杆菌流行情况，检测与水平转移密切相关接合性质粒traA、trbC及Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型整合子分布状况。对哈尔滨周边地区发病猪场采样处理，得到24株大肠杆菌。采用Kirby-Bauer法对24株大肠杆菌进行14种药物药敏试验，并采用聚合酶链式反应（PCR）法分析接合性质粒遗传标记traA、trbC及Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型整合子。结果显示大多数猪源大肠杆菌对14种抗菌药物均表现出较高耐药性，有些细菌甚至对其中12种药物产生耐药性。试验细菌对氟苯尼考、磺胺甲恶唑／甲氧苄啶（SXT）和多西环素（DOX）耐药率最高，分别可达100％、95．83％和83．33％。traA和trbC检出率分别为91．67％（22／24）、62．5％（15／24），Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型整合子检出率分别为91．67（22／24）、12．5（3／24）和0。结果表明哈尔滨周边地区猪源大肠杆菌耐药现象十分严重，接合性质粒和整合子检出提示可能存在耐药性水平转移现象。

耐药大肠杆菌内质粒编码β—内酰胺酶的研究

从临床上分离到一株大肠杆菌HX88108,该菌对头孢哌酮等多种抗生素高度耐药。前期实验表明此菌含有四个不同分子量及耐药性的质粒(PFC、PFT1、PFT2、PFT3),并获得了具有这四个质粒的四株转化菌。本文首先用Nitzocefin法检测到Ecoli HX88108及其四株转化菌都能产生β—内酰胺酶对头孢哌酮等四种头孢菌素的稳定性实验显示四个粒所编码的β—内酰胺酶对四种头孢菌素的水解率及水解扫描光谱各不相同。

新疆多源喹诺酮类耐药大肠杆菌耐药基因检测及分析

【目的】了解新疆不同动物源喹诺酮类耐药大肠杆菌携带质粒介导的喹诺酮耐药因子(plasmid mediated quinolone resistance,PMQR)的流行现状,及其与主要的β-内酰胺酶基因和16S rRNA甲基化酶基因的共存情况。【方法】通过PCR方法对猪源(79株)、牛源(8株)和羊源(96株)喹诺酮类(环丙沙星,诺氟沙星和恩诺沙星)耐药大肠杆菌进行PMQR(qnrA,qnrB,qnrC,qnrD,qnrS,qepA,oqxA,oqxB,aac(6’)-Ib-cr)、β-内酰胺酶基因(blaTEM,blaCTX-M,blaSHV,blaKPC,blaCMY-2,blaLAP-1)及16S rRNA(armA,rmtB)等基因检测,对目的条带进行DNA测序,确定阳性菌株,对检出携带β-内酰胺酶基因和16S rRNA甲基化酶基因的大肠杆菌进行β-内酰胺类及氨基糖苷类药敏试验,分析其携带的基因型与耐药表型之间的关系。【结果】猪源大肠杆菌中检出的PMQR因子为qnrS(5/79,6.33%),oqxA(35/79,44.30%),oqxB(40/79,50.60%)和aac(6’)-Ib-cr(4/79,5.06%),检出的β-内酰胺酶基因为blaTEM(79/79,100%),检出的16S rRNA基因为rmtB(3/79,3.80%);牛源大肠杆菌中检出的PMQR因子为qnrS(1/8,12.50%),oqxA(1/8,12.50%),oqxB(1/8,12.50%)和aac(6’)-Ib-cr(1/8,12.50%)和qepA(1/8,12.50%),检出的β-内酰胺酶基因为blaTEM(8/8,100%)和blaSHV(1/8,12.50%);羊源大肠杆菌中检出的PMQR因子为qnrS(6/96,6.25%),oqxA(32/96,33.3%),oqxB(37/96,38.5%)和aac(6’)-Ib-cr(22/96,22.91%),检出的β-内酰胺酶基因为blaTEM(96/96,100%)和blaCTX-M(2/96,2.08%),检出的16S rRNA基因为rmtB(2/96,2.08%);未检出qnrA,qnrB,qnrC,qnrD,blaKPC,blaCMY-2和blaLAP-1被检基因。不同动物源大肠杆菌中存在基因共存现象,携带β-内酰胺酶基因和16S rRNA甲基化酶基因的喹诺酮类耐药大肠杆菌对β-内酰胺类和氨基糖苷类药物耐药呈一定的相关性。【结论】不同动物源喹诺酮类耐药大肠杆菌中存在PMQR因子,可与主要的β-内酰胺酶和/或16S rRNA甲基化酶基因共存。此外,首次在羊源大肠杆菌中检出PMQR因子、β-内酰胺酶及16S rRNA甲基化酶基因。

蒲公英水提物联合抗菌药对含CTX-M基因多重耐药大肠杆菌的体外抑菌效果研究

为了研究蒲公英水提物与抗菌药对CTX-M型产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠杆菌的体外联合抑制效果,为畜牧业的用药提供参考依据。通过PCR的方法选取了含有CTX-M基因的大肠杆菌为受试菌株;采用微量肉汤二倍稀释法,测定了蒲公英水提物和11种抗菌药单独使用时,各药物对该大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC);采用微量肉汤传代法和微量棋盘法,测定了蒲公英水提物与11种抗菌药联合使用时,二者联合对该大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小部分抑菌浓度指数(FICI)。结果显示,蒲公英对受试大肠杆菌的MIC值为250 mg/mL,在与痢菌净、氟苯尼考、阿奇霉素和利福平的联合传代和棋盘试验中发现,蒲公英与这4种抗菌药联用可降低抗菌药MIC且联合使用效果均为相加作用。表明蒲公英与这4种抗菌药联用可增强4种抗菌药的效果,可减少畜牧生产中抗菌药的使用量。

丁香酚对多重耐药大肠杆菌的抑菌活性及其作用机制研究

为研究丁香酚对多重耐药大肠杆菌(Multidrug-resistant Escherichia coli,MDR E.coli)的抑菌活性,利用微量二倍稀释法和琼脂扩散法确定丁香酚对多重耐药大肠杆菌的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC),并利用紫外分光光度法、考马斯亮蓝法等方法初步分析其作用机制。结果表明,丁香酚对MDR E.coli的MIC和MBC分别为2.50 mg/mL和5.00 mg/mL;丁香酚可延长MDR E.coli迟缓期进入对数生长期的进程,改变菌体结构,增加菌株可溶性蛋白的含量和胞外核酸的量,增大菌体培养液中的电导率,对MDR E.coli具有较强的抑菌作用,这些作用可能归因于丁香酚对其细胞结构的破坏。本研究为临床有效缓解或解决多重耐药大肠杆菌的耐药、感染和致死率等问题提供新的思路、新途径,并为其在医药和食品开发领域的应用奠定理论基础。

不同环境胁迫因子对猪源耐药大肠杆菌生长的影响

【目的】探究环境胁迫因子对猪源多重耐药大肠杆菌生存适应性的影响,为创造多重耐药菌株带来高适应代价的环境及加速降低种群耐药水平提供理论依据。【方法】以分离自贵州省规模化猪场的多重耐药大肠杆菌QL15为研究对象,以大肠杆菌质控(敏感)菌株ATCC25922为对照,经体外竞争试验测定不同环境(培养基浓度、碳源、氮源、pH和温度)胁迫下耐药菌株QL15相对于敏感菌株ATCC25922的适应性,并通过重测序变异位点和实时荧光定量PCR测定分析耐药基因表型及外排泵和外膜孔道蛋白基因表达与细菌适应性代价的关系。【结果】耐药菌株QL15在体外独立及混合培养时,除在稀释LB培养基(1/4、1/8和1/16)中的长势较敏感菌株ATCC25922低外,在低碳源(0.1%和0.5%)、低氮源(0.01%和0.05%)、酸碱性(p H=5.0、pH=6.0和pH=8.0)及低温(20℃)和高温(42℃)胁迫下的生长均优于敏感菌株ATCC25922,且混合培养结果优于独立培养。将耐药菌株QL15基因组序列与敏感菌株ATCC25922基因组序列进行比对,共检测到509个InDel突变位点,其中Delete突变位点233个、Insert突变位点276个;共注释到71个功能基因,以细胞壁与细胞膜相关基因突变最多(10个),占14.1%。与敏感菌株ATCC25922相比,耐药菌株QL15在不同环境胁迫下其外排泵与外膜孔道蛋白相关基因emr B、acr B、tol C和omp C呈下调表达,而omp F基因呈上调表达。【结论】多重耐药大肠杆菌耐药性的获得促使其具有更强的适应性,但对可直接利用营养物质的获取弱于敏感菌株,即处于竞争劣势。耐药大肠杆菌的多重耐药性主要是由多种外排泵和外膜孔道蛋白介导完成,其中,omp F基因在pH胁迫、全营养胁迫和高、低温胁迫下均处于上调表达状态,故推测omp F基因的高表达有利于大肠杆菌在上述胁迫条件下生长。

纳米TiO2和四环素暴露对耐药大肠杆菌的影响

以耐药大肠杆菌(M13)和敏感质控菌株(E.coli ATCC25922)为研究对象,探究纳米TiO2和四环素对大肠杆菌生长的影响。结果表明,与单独添加梯度浓度四环素相比,纳米TiO2的加入进一步抑制了敏感菌的生长,而耐药菌变化不大。纳米TiO2单独和联合暴露下对耐药菌的抑菌率均在40%以下,而敏感菌在80%-100%之间,耐药菌M13除了耐抗生素,对纳米TiO2也存在抗性。微生物对抗生素和其它环境毒性因子的抗性机制存在着一些共性,但在共暴露条件下微生物的抗性机制还有待进一步研究。

连翘联合抗菌药物对多重耐药大肠杆菌B_3的抗菌试验

目的:测定连翘水煎剂及其与抗菌药物联合对多重耐药大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)B_3菌株的抑菌效果。方法:采用牛津杯法测定连翘对B_3菌的抑菌作用,利用微量肉汤稀释法测定连翘、四环素和磺胺间甲氧嘧啶钠对B_3菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC);通过棋盘稀释法来测定连翘和上述抗菌药物的联合抑菌效果。结果:连翘能抑制多重耐药大肠杆菌B_3菌株的生长繁殖,呈现抗菌作用;试验药物对B_3菌株的最小抑菌浓度分别为连翘125.0mg/mL、四环素12.8 mg/mL、磺胺间甲氧嘧啶钠50.0 mg/mL;部分抑菌浓度(fractional inhibitory concentration,FIC)指数结果显示连翘与四环素联合呈相加作用,连翘与磺胺间甲氧嘧啶钠联合呈无关作用。本试验为兽医临床解决细菌耐药问题提供了用药新思路,同时为开发中草药制剂提供依据。

苦豆子提取物对多重耐药大肠杆菌的体外抑菌作用

为探究苦豆子提取物对多重耐药大肠杆菌的体外抑菌作用,本研究以从蛋鸡粪便样本中分离的1株多重耐药大肠杆菌为研究对象,测定了苦豆子提取物的最小抑菌浓度(MIC)以及与抗菌药物联用的抑菌效果,并测定了对多重耐药大肠杆菌生长曲线、生物被膜以及运动能力的影响。结果表明,苦豆子提取物MIC为125 mg/mL,与头孢噻呋联用呈现协同作用;与对照组相比,1/2MIC和MIC的苦豆子提取物可明显抑制菌株的生长;不同浓度苦豆子提取物对菌株生物被膜具有一定程度的抑制和清除作用,1/2MIC和MIC组可极显著降低菌株的运动能力(P<0.01)。表明苦豆子提取物对多重耐药大肠杆菌具有良好的体外抑菌作用。

苦参苍术口服液对鸡耐药大肠杆菌的疗效试验

为考察苦参苍术口服液对鸡耐药大肠杆菌的临床应用效果,对其进行了临床疗效试验。试验结果表明:1L饮水中添加苦参苍术口服液1mL^2mL,连用5天,能明显降低鸡人工感染耐药大肠杆菌病引起的死亡率,且对人工感染大肠杆菌引起的鸡只生长发育受阻有一定程度的改善作用。苦参苍术口服液与乳酸诺氟沙星联合使用时,疗效明显增强,与乳酸诺氟沙星阳性对照组相比,发病率明显降低(p<0.01),有效率明显升高(p<0.01)。

植物乳杆菌XCT1-1对鸡肉表面耐药大肠杆菌的抑制作用

利用植物乳杆菌XCT1-1细菌素粗提物、阿奇霉素对鸡肉中耐药性大肠杆菌的抑制作用进行探测研究.选定细菌菌落总数、pH、TVB-N、持水力等4个指标判定细菌素粗提物对鸡肉本身安全性的影响.由此得出,单独添加XCT1-1粗提物或与阿奇霉素混合添加可明显抑制鸡肉中细菌的生长繁殖.和对照组进行对比,第10 d时单独添加XCT1-1粗提物或与阿奇霉素共同添加的处理组细菌菌落总数分别降低了1.45 log CFU/g和2.25 log CFU/g,TVB-N值降低了31.40%和39.38%,持水力降低速率减缓了10.87%、28.87%,且延缓了pH的增加.各项指标反映菌株XCT1-1细菌素粗提物单独使用或者和阿奇霉素协同作用能使感染耐药性大肠杆菌的鸡肉货架期延期2~4 d.本研究证实植物乳杆菌XCT1-1细菌素粗提物可有效控制鸡肉中感染的耐药性大肠杆菌生长,为乳酸菌生物制剂替代抗生素的研究提供理论依据.

关于29种中药营养价值及对耐药大肠杆菌抑菌活性分析

目的探究29种中药营养价值及分析中草药对耐药大肠杆菌的抑菌活性,为临床诊治提供可靠依据。方法使用平皿倍比稀释法,测定29种中草药对鸡源性大肠杆菌、猪源性大肠杆菌K8、大肠杆菌ATCC25922的体外抑菌活性。结果对抗生素都敏感的是猪源性大肠杆菌K8,对抗生素均不敏感的是鸡源性大肠杆菌,显现耐药性趋势。对于不同的大肠杆菌,29种中草药呈现出的抑菌活性强度明显不同,活血化瘀和清热解毒中草药对大肠杆菌的抑菌作用较明显,丹参、半桂枝提取物对猪源性大肠杆菌K8和鸡源性大肠杆菌的抑菌作用特别明显,女贞子、连翘、白鲜皮、赤芍对大肠杆菌的抑菌作用也较明显。结论丹参、半桂枝、女贞子、连翘、白鲜皮、赤芍对大肠杆菌的抑菌作用较明显。

一株C3形态多重耐药大肠杆菌噬菌体生物学特性和基因组分析

【目的】多重耐药菌的出现对公共卫生安全构成严重威胁,本研究分离多重耐药大肠杆菌噬菌体,研究其生物学特性和基因组特征,为耐药菌的噬菌体疗法提供理论依据。【方法】使用双层平板法从污水样本中分离纯化大肠杆菌噬菌体;磷钨酸染色后通过透射电镜观察形态;测定其宿主范围,测定温度和pH稳定性、一步生长曲线和体外抑菌效果等生物学特性;体内抑菌试验评估噬菌体对多重耐药大肠杆菌N1203-1Af感染的大蜡螟幼虫的保护作用;基于全基因组测序对其基因组特点进行分析。【结果】本研究分离共得到5株大肠杆菌噬菌体,分别命名为pEC-S163-2.1、pEC-S163-2.2、pEC-M1167-5Ar.1、pEC-m1291-2Dr.1和pEC-N1203-2Af.1;电镜结果显示噬菌体pEC-N1203-2Af.1属于短尾噬菌体中罕见的C3形态型,头部较长,长是宽的2–3倍;pEC-N1203-2Af.1可裂解受试15株大肠杆菌中的3株;感染10 min后进入指数增长期,–20−50℃、pH值为4.0–10.0的环境下均能够保持稳定活性;大蜡螟幼虫感染大肠杆菌N1203-2Af后噬菌体pEC-N1203-2Af.1治疗感染复数(multiplicity of infection,MOI)=100、1和0.01在48 h内存活率均达到70%以上(7/10);噬菌体pEC-N1203-2Af.1基因组全长77334 bp,(G+C)%含量为42.18%,不携带耐药基因和毒力因子;功能基因预测表明,噬菌体pEC-N1203-2Af.1基因组共有121个CDS,其中CDS53–CDS64是编码噬菌体结构和裂解模块的序列。【结论】多重耐药大肠杆菌噬菌体pEC-N1203-2Af.1具有良好的抑菌活性,生物学特性稳定,可能为Kuravirus属的新成员,其具有罕见的C3形态,这种头部细长的特殊形态可能与CDS63编码的主要头部蛋白有关。不同地区的C3形态噬菌体长尾纤维远端三聚体蛋白一致性小于50%,推测该形态噬菌体为适应不同的环境可能发生了不同方向的进化。