诱变法选育产耐酸α-淀粉酶菌株的研究

以黑曲霉AS-Y菌株为出发菌株,通过紫外线、甲基磺酸乙酯及2种方法组合诱变以达到提高其产耐酸α-淀粉酶的能力。结果表明:利用紫外线与甲基磺酸乙酯相结合的复合诱变法,可以筛选得到一株高产、较稳定的产耐酸α-淀粉酶菌株AS-EUⅢ,其酶活由野生株的64.3U/g增至突变株的198.8U/g。

产耐酸性α-淀粉酶菌株的筛选及其固态发酵条件的优化

以酒糟为原料,应用锥虫蓝法,通过比较透明圈直径与菌落直径的比值,能较快选出目的菌株,经筛选得到1株产耐酸性-α淀粉酶的野生AS-Y菌株,其酶活达到64.3U/g。通过鉴定为曲霉AS-Y菌株,并对AS-Y菌株的固态发酵条件进行了优化。

耐酸性α-淀粉酶产生菌筛选及培养基优化

从酒曲中筛选得到1株产耐酸性α-淀粉酶的菌株,经26S rDNA鉴定为小孢根霉(Rhizopus microsporus var)。通过单因素试验和响应面分析法对该菌株的培养基组分进行优化,得到最佳的培养基组成为加水量11.156mL,麸皮与豆饼比4.145∶1,MgCl20.0772%。在此条件下培养,酶活达到259.902 U/g干物质。

快速筛选耐酸性α-淀粉酶生产菌株的平板透明圈法

以可溶性淀粉为底物配制固体培养基,然后低温处理(4℃)平板培养物,产淀粉酶的菌株其菌落周围的培养基由白色变成灰色且透明.该方法不具有破坏性,不需要预先接种菌落,能直接发现和分离分解利用淀粉的微生物.利用淀粉琼脂平板还能快速验证淀粉酶的耐酸性,根据在pH4.2和pH6.0的琼脂平板上透明圈的直径d与淀粉酶活力的对数lnA的关系,求出淀粉酶在pH4.2和pH6.0时的淀粉酶活力.pH4.2时比pH6.0时的比值大,说明该淀粉酶产生菌的耐酸性较强.

耐酸性α-淀粉酶的分离提取及性质研究

目的以选育得到的耐酸性α-淀粉酶生产菌株黑曲霉Tx-78为出发菌株,对耐酸性α-淀粉酶的分离提取方法及其性质进行研究。方法通过液体发酵、减压浓缩及进一步提取得到粗酶制剂,对其最适宜反应温度、pH进行测定,对其稳定性及动力学性质进行研究。通过薄层层析对其水解淀粉的最终产物进行分析。结果该酶最适宜反应pH为4.0,最适宜反应温度为70℃。当Ca2+浓度为7 mmol/L时其作用最明显。动力学研究表明该酶的Km值为7.89 g/L。薄层层析结果表明,该酶制剂水解淀粉最终产物为麦芽糖和葡萄糖。结论该酶具有良好的耐酸性和耐热性,Ca2+对其有促进作用,能够实现在酸性条件下淀粉液化和糖化的同步进行,具有良好的应用前景。

耐酸耐高温α-淀粉酶的研究进展

介绍了耐酸耐高温α-淀粉酶在工业生产中具有经济、节能、方便操作等优势;并且概述了耐酸耐高温α-淀粉酶的菌种来源,其中耐酸性α-淀粉酶的菌种主要来源于芽孢杆菌、曲霉以及嗜热真菌;耐高温α-淀粉酶的菌种主要来源于凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和嗜热网络球杆菌等;本文还对耐酸耐高温α-淀粉酶的菌种选育技术方法包括物理方法、化学方法以及基因操作技术等进行了阐述。研究发现对耐酸耐高温α-淀粉酶的发酵工艺进行优化后,最高可以使酶活提高2.1倍;同时在对该淀粉酶的钙离子依赖性进行研究中,得出某些耐酸耐高温α-淀粉酶具有不依赖Ca2+的特性;最后预测人们将会运用基因工程等技术手段,不断地开发出各种特性的耐酸耐高温性α-淀粉酶。

耐酸性α-淀粉酶产生菌的选育

从醋醅中筛选得到一株产耐酸性α-淀粉酶的野生菌ASA-1,经初步鉴定为假丝酵母属的水生假丝酵母(Candidaaquatica),以ASA-1为出发菌株,通过紫外诱变(UV)和硫酸二乙酯(DES)复合诱变,获得产酶较高的ASA-UD86菌株,酶活达到146u/g。

黑曲霉Tx-78耐酸性α-淀粉酶的分离纯化及其性质研究

从酒曲中选育得到产耐酸性α-淀粉酶的嗜酸性黑曲霉菌株Tx-78,经酒精沉淀,CM52和DE52纤维素离子交换层析对该酶进行纯化,通过SDS-PAGE检验其纯度并测得其分子量为74 ku。该耐酸性α-淀粉酶具有显著的热稳定性及酸稳定性,其最适反应温度与pH分别为70℃和pH 4.0。当反应温度低于60℃时,该酶在pH 4.0条件下可保持稳定活性达3 h以上。Ca2+、Ba2+对提高酶活力具有明显作用。薄层层析表明该酶制剂水解淀粉最终产物主要为麦芽糖和葡萄糖。

产耐酸性α-淀粉酶菌株固态发酵条件的优化

对产耐酸性α-淀粉酶黑曲霉菌株AS-Y的固态发酵条件进行了优化。经过单因素实验和正交试验,影响产耐酸性α-淀粉酶的菌株产酶量的主要因素为含水量>接种量>附加氮源>Ca2+。固体发酵条件中,水:麸皮为1∶1,麸皮量为15g,接种量为4mL,温度为30℃～32℃。发酵培养基中,麸皮:硫酸铵为1:0.05,CaCl2为0.01g。在上述最佳的发酵条件下,确定其固体发酵时间为60h～72h,酶活达到286.64U/g。

氮离子注入选育耐酸性α-淀粉酶产生菌诱变效应的研究

利用低能(30 keV)氮离子注入中温中性α-淀粉酶产生菌枯草芽孢杆菌BF7658,研究对其产耐酸性α-淀粉酶的诱变效应.结果表明,BF7658菌株存活率曲线是典型的"马鞍型"剂量-效应曲线,在"马鞍型"区域对应注入剂量50×1014～100×1014 ions/cm2下具有较高的突变率.通过诱变筛选到一株最适作用pH为5.0,较出发菌株的最适作用pH偏低一个单位的突变株,编号TUST743.该突变株产酸性α-淀粉酶的酶活为343 U/mL.该酶在pH4.5和4.0条件下的相对酶活为61%和38%,说明此突变株所产酸性α-淀粉酶对低pH有较好的耐受性.经连续传代实验,表明该菌株遗传性质稳定.

耐酸性高温α-淀粉酶突变基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用表达载体pET-30a，实现了去信号肽的耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd及未突变的高温”淀粉酶基因amy在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达。经多步纯化，重组酶AMY及AMYD的比活分别达到312．7U／mg蛋白和354．6U／mg蛋白，纯化倍数分别为75．90和83．83，获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品，经SDS-PAGE检测，AMY及AMYD酶分子质量均为63．5ku。重组酶AMY的最适温度80℃，最适反应pH为6．5，在温度低于90℃，反应pH5．5～7时，酶活较稳定。重组酶AMYD的最适温度80℃，最适反应pH为4．5，在温度低于90℃，反应pH4．0～6．5时，酶活较稳定。

枯草芽孢杆菌工程菌产耐酸性高温α-淀粉酶发酵条件的优化

利用基因工程手段获得的产耐酸性高温α-淀粉酶基因枯草芽孢杆菌工程菌株pWB-amyd/WB600,通过单因素筛选及正交实验进行发酵培养基优化,得到的最佳配方为(g/L):玉米粉20,蛋白胨30,CaCl20.5,Na2HPO48.同时对实验室摇瓶条件下液体发酵的主要影响因素初始pH、接种量、装液量、转速、温度等进行探讨,确定了最佳培养条件:37,℃、pH 6.5、200,r/min摇床培养36,h,接种量为2%,装液量为30,mL/250,mL.在此优化条件下,耐酸性高温α-淀粉酶活力达到3,980,U/mL,是未优化条件下的2.1倍.

耐酸性α-淀粉酶高产菌株的选育

从酒曲中筛选得到1株高产耐酸性α-淀粉酶的野生菌株Tx-78,经鉴定为曲霉属的黑曲霉(Aspergil-lus niger)。以Tx-78作为出发菌株,通过紫外线(UV)诱变和亚硝基胍(NG)诱变,获得了遗传稳定的高产菌株UN78358,其产酶量可达到1 120 U/mL。

耐酸性α-淀粉酶发酵动力学的研究

以AS-EUⅢ为发酵的出发菌株,进行10L发酵罐扩大培养发酵,确定了建立三个动力学模型,它们的线性拟合度达到95%以上,能较好地描述所建立的模型,为以后进一步研究和预测耐酸性α-淀粉酶发酵过程奠定了理论基础。

耐酸性α-淀粉酶酶促反应动力学研究

在耐酸性α-淀粉酶产生菌发酵条件优化基础上,进一步研究了耐酸性α-淀粉酶酶促反应动力学,确立了酶促反应最适合pH范围为3.0-5.0,pH4.5最佳。反应进程曲线表明在一定浓度范围内,产物浓度随底物浓度的增加而增加,当底物浓度过大时,存在底物抑制。M-M动力学研究表明该酶Km为6.04881 g/l,葡萄糖对酶促反应有抑制且为竞争性抑制。

新型耐酸性α-淀粉酶液态发酵条件的研究

通过基因工程技术导入了产生耐酸性α-淀粉酶和糖化酶的多考贝融合基因而获得的白曲霉基因工程菌株TR12作为试验菌株,分别在摇瓶条件下和2L通气发酵罐上进行耐酸性α-淀粉酶的液态发酵工艺条件的试验研究。正交试验结果表明,优化摇瓶发酵培养基配方A3B3C2D1,即玉米粉4%,玉米浆1.5%,黄豆粉2%,麸皮4%,摇瓶产酶活力81.69u/mL,2L发酵罐的产酶活力达到了83.6u/mL的水平。

耐酸性高温α-淀粉酶突变基因的异源表达及纯化

将去信号肽的耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a上，实现重组质粒pET-amyd在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达。经硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析，重组酶AMYD的比活达到354．6U·mg^-1、纯化倍数为83．83，获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品，经SDS-PAGE检测，AMYD酶分子量为63．5kDa。重组酶AMYD的最适温度80℃、最适反应pH值为4．5，在温度低于90℃、反应pH值4．0～6．5的条件下，酶活较稳定。

海藻酸钙固定水生假丝酵母生产耐酸性α-淀粉酶

介绍了以海藻酸钙为载体,对水生假丝酵母进行包埋固定处理,并利用这种固定化细胞生产酸性α-淀粉酶的方法。实验表征了固定化过程的工艺条件对海藻酸钙固定化水生假丝酵母细胞的结构、机械强度和产酶性能的影响,确定了最优的工艺条件为:在30℃条件下,将2.8%海藻酸钠、0.6%的菌体的混合液体,通过注射器缓慢注入4%CaCl2溶液中固定4h。这种固定化细胞的产酶能力为70.24U/mL,比游离细胞高9.45倍。

N^+离子注入诱变选育耐酸性α-淀粉酶高产菌株

本工作研究低能N+离子注入中温α-淀粉酶产生菌BF7658的诱变方法。经不同注量的N+离子注入实验后,得出N+离子最佳注量为1×1016 cm-2,并筛选获得1株耐酸性α-淀粉酶产量较高的枯草芽孢杆菌突变株。该突变株所产α-淀粉酶的酶活可达207U/mL,遗传稳定性较好。

耐酸耐高温α-淀粉酶及其菌种选育研究进展

耐酸耐高温α-淀粉酶能在高温与低p H下水解淀粉,是重要的新型工业酶制剂。概述了耐酸耐高温α-淀粉酶的热稳定性、p H稳定性及金属离子对其的影响,阐述了产酶菌种的主要来源现状,并重点对耐酸耐高温α-淀粉酶诱变育种的复合诱变、基因工程定点突变等菌种选育和古菌的相关研究进行了综述。