耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

高温α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现高温α-淀粉酶基因的高效表达,本研究比较了不同启动子对地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中表达的影响.分别用强启动子P43和地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因自身启动子构建了表达载体pP43NMK-amy和pUBC19-amy,并在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis1A752S中进行表达.结果表明,与地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因自身启动子相比,采用P43启动子的耐高温α-淀粉酶其表达水平提高了8.9倍.而且在枯草芽孢杆菌B.subtilis1A752S中分泌表达的α-淀粉酶仍具有耐高温的特性,酶反应的最适温度为90℃,表明酶的热稳定性由蛋白质本身的氨基酸序列决定的.

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其产物的分泌

以耐高温α 淀粉酶生产菌地衣芽孢杆菌染色体DNA为模板 ,通过PCR扩增耐高温α 淀粉酶基因 ,将扩增产物 1 9kb的DNA片段插入到pUC1 9质粒中 ,再转化大肠杆菌JM1 0 9,通过在淀粉平板上形成透明圈等方法筛选到一株阳性克隆菌株JM1 0 9(pUAM) ,其表达产物可分泌到培养基中 ,除去菌体的发酵液中每 1 0 0mL酶活可达到 2 7个单位。将发酵上清液浓缩后用冷无水乙醇分级沉淀 ,所得样品进行SDS PAGE分析 ,得到分子质量为 60ku的目的蛋白带。

合成耐高温α-淀粉酶基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

PFA是来源于Pyrococcus furious的一种耐高温α-淀粉酶,为了使PFA能够在巴斯德毕赤酵母中高效表达,根据巴斯德毕赤酵母密码子的偏好性对PFA的基因序列进行密码子优化,人工合成耐高温淀粉酶PFA基因pfa,并连接到巴斯德毕赤酵母中表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-pfa。重组质粒线性化后转化到巴斯德毕赤酵母菌株GS115中,重组菌株在摇瓶中用甲醇诱导表达,分泌表达酶活最高为220 U／L。

来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达

来源于Pyrococcusfuriosus的耐高温α-淀粉酶是一种重要的酒精工业用酶,在植物中表达耐高温α-淀粉酶可以大大降低用植物秸秆生产酒精的成本。选择衣藻叶绿体基因组同源片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2和壮观霉素抗性基因,构建了来源于Pyrococcusfuriosus的耐高温α-淀粉酶基因的衣藻叶绿体表达载体p64A。通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中,经壮观霉素抗性(100mg/L)筛选,获得了9个抗性衣藻转化子。转化子经过抗性继代筛选后,经PCR、Southernblot检测分析及暗培养,证实耐高温α-淀粉酶基因已整合到衣藻叶绿体基因组中并得到表达。酶活性检测表明,转基因衣藻表达产物具有耐高温α-淀粉酶活性,每克鲜重衣藻最高达77.5u。实验结果证明在植物叶绿体中表达工业酶制剂是可行的。

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因工程菌的研究进展

综述了国内外地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因工程菌的研究进展,并就基因工程菌的优缺点进行了简要分析.

耐高温α-淀粉酶基因改造研究进展

耐高温α-淀粉酶是重要的工业用酶制剂之一,主要介绍耐高温α-淀粉酶的基因改造研究进展。

地衣芽孢杆菌CICC10181耐高温α-淀粉酶基因的纯化及克隆

目的利用PCR技术对地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因分离及纯化,转染大肠杆菌DH5α进行克隆表达。方法利用CaCl_2转化法转化所筛选的α-淀粉酶基因,然后利用PCR技术获得α-淀粉酶基因的阳性克隆。结果把筛选的基因成功连接到PET28α载体上,转染大肠杆菌,进行阳性克隆鉴定,得到耐高温α-淀粉酶基因的阳性克隆。结论根据实验结果鉴定得到高活性耐高温的α-淀粉酶基因表达菌株。

耐高温α-淀粉酶基因在枯草杆菌染色体上的整合、扩增及表达的研究

通过构建一套整合载体，将来自嗜热脂肪芽孢杆菌的耐高温α－淀粉酶基因以及质粒ｐＣ１９４上的一段Ｃｍ抗性基因随机整合至枯草杆菌１Ａ２８９染色体上，通过提高整合菌的抗氯霉素能力和反复进行整合，可提高耐高温α－淀粉酶基因在染色体上的拷贝数，最终耐高温α－淀粉酶基因在染色体上的拷贝数由整合初的一个增至七个以上。同时，在无选择压力的情况下。

耐高温α-淀粉酶基因在马铃薯中的表达

我们将从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheni-formis)克隆的约1.68kb的耐高温α-淀粉酶基因构建成表达载体,并转入根癌农杆菌。以马铃薯栽培品种“杂交荷兰7号”块茎圆盘为外植体,按本实验室建立起的再生实验系统及杨美珠等的方法进行转化。采取共培养、芽的诱导、芽的选择再生三步方法获得抗性芽。将抗性芽通过先诱导生根壮苗,再进行卡那霉素筛选,最后再诱导生根的方法得到可能的转基因植株。对部分可能的转基因植株按改进的王广立等的PCR简单快速鉴定转基因植物的方法进行检测,株号102001、102607、110402均可见到特异性片段的存在。参照张振清及王福荣等的方法对这些植株进行耐高温α-淀粉酶活力测定,这些植株具有相对较强的耐高温α-淀粉酶活性。实验结果表明,耐高温α-淀粉酶基因可能已转入上述植物基因组中,并获表达。

发芽小麦高温α-淀粉酶挤压膨化工艺优化

为解决酿造食品工业中小麦原料还原糖和阿魏酸含量低的问题,利用高温α-淀粉酶挤压膨化处理技术对发芽小麦进行预处理,基于外源酶、内源酶与高温膨化共同作用促进原料中淀粉水解,以期提高其中的还原糖和阿魏酸含量。通过单因素和正交试验,确定最佳工艺条件为物料水分30%、加酶量0.18%、末端机筒温度90℃、螺杆转速80 r/min。在此条件下,还原糖和阿魏酸含量分别为38.39%和3.78 mg/g。与小麦原料和单一发芽处理相比,还原糖含量分别提高481.67%和20.95%,阿魏酸含量分别提高131.90%和38.97%。通过冷场发射扫描电镜(cold field emission scanning electron microscope,Cold FESEM)、傅里叶转换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、高效体积排阻色谱(high performance size exclusion chromatography,HPSEC)表征,观察到发芽小麦的淀粉结构被破坏,其结晶度、短程有序度、重均分子量降低。高温α-淀粉酶挤压膨化处理发芽小麦能够促进还原糖的生成和阿魏酸的释放,为后续发酵食品的生产提供更好的发酵条件和更多的风味前体物质。

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的克隆、烟草瞬时表达及转化拟南芥的研究

从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中克隆到耐高温α-淀粉酶基因全长,构建了原核表达载体,转入大肠杆菌(Escherichia coli)中,使用IPTG于28℃诱导6小时后,通过SDS-PAGE检测到目的蛋白,分子量约为55 kDa,并通过酶活力检测实验证明该蛋白具有耐高温α-淀粉酶活性。同时构建了该基因融合GFP的植物表达载体,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导瞬时转化烟草(Nicotiana tabacun)下表皮细胞并在荧光显微镜下观察,发现在烟草下表皮细胞的细胞质和液泡中均有绿色荧光。使用I_2-KI溶液对乙醇脱色后的烟草叶片进行染色,显色反应表明在烟草中表达的耐高温α-淀粉酶具有酶活性。最后,采用农杆菌介导的花蕾浸泡法将重组载体转化到拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,筛选到稳定遗传的耐高温α-淀粉酶基因的拟南芥纯合子。研究结果为后期开展表达耐高温α-淀粉酶的转基因植物的相关研究奠定了实验基础。

耐高温酸性α-淀粉酶基因部分序列的克隆与分析

利用已报道的α-淀粉酶基因序列的保守区域设计引物,通过聚合酶链式反应(PCR)获得了高温球菌Thermococcus sp. HJ21的耐高温酸性α-淀粉酶基因的部分序列。通过对该序列的同源性比较分析发现,高温球菌Thermococcus sp. HJ21与热水高温球菌Thermococcus hydrothermalis和Thermococcus sp. OGL-20P的亲缘关系最近,序列相似度达到95%以上;利用Swiss Model预测该基因产物的3级结构,显示其具有典型的(β/α)8桶状结构;通过分析密码子的使用情况得知,该α-淀粉酶存在着密码子的兼并性和使用的偏向性问题。

耐酸性高温α-淀粉酶突变基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用表达载体pET-30a，实现了去信号肽的耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd及未突变的高温”淀粉酶基因amy在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达。经多步纯化，重组酶AMY及AMYD的比活分别达到312．7U／mg蛋白和354．6U／mg蛋白，纯化倍数分别为75．90和83．83，获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品，经SDS-PAGE检测，AMY及AMYD酶分子质量均为63．5ku。重组酶AMY的最适温度80℃，最适反应pH为6．5，在温度低于90℃，反应pH5．5～7时，酶活较稳定。重组酶AMYD的最适温度80℃，最适反应pH为4．5，在温度低于90℃，反应pH4．0～6．5时，酶活较稳定。

一株热反硝化地芽孢杆菌Y62产耐高温α-淀粉酶的异源表达

为获得耐高温α-淀粉酶的菌株,该研究从常年覆盖热油的土壤中分离筛选产耐高温淀粉酶的细菌,通过形态学、生理生化分析和16S rRNA鉴定菌株种属,对筛选出的菌株进行中试工程化发酵产酶,下游酶分离中利用简便的硫酸铵沉淀法分离粗酶,并且对分离纯化的耐高温淀粉酶提取物进行热稳定评价。克隆菌株耐高温淀粉酶的基因序列并用于构建表达载体,在大肠杆菌BL21中成功进行异源表达,并对所产淀粉酶进行生物信息学分析。结果表明:通过筛选获得一株产淀粉酶的热反硝化地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)Y62,中试放大后在48 h取得112.7 U/mL酶活,其粗酶回收率可达90.2%。该淀粉酶具有良好的耐高温特性,在100℃下仍能保持37.8%的活性。异源表达产物以包涵体的形式存在,改变诱导条件后溶出可溶性蛋白,纯化产物经过质谱鉴定后确定该淀粉酶为α-淀粉酶。生物信息学分析及预测表明该耐高温淀粉酶编码511个氨基酸,分子量为59.86 kDa,含2个跨膜区域、3个催化位点和2个Ca2+结合位点,与已报道的α-淀粉酶GTA相似。

耐酸性高温α-淀粉酶突变基因的异源表达及纯化

将去信号肽的耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a上，实现重组质粒pET-amyd在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达。经硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析，重组酶AMYD的比活达到354．6U·mg^-1、纯化倍数为83．83，获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品，经SDS-PAGE检测，AMYD酶分子量为63．5kDa。重组酶AMYD的最适温度80℃、最适反应pH值为4．5，在温度低于90℃、反应pH值4．0～6．5的条件下，酶活较稳定。

地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因的克隆及原核表达

地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)是产生具有重要工业生产价值的耐高温α-淀粉酶(α-amy lase)的优良菌株.本实验在提取地衣芽孢杆菌完整的基因组DNA序列的基础上,通过PCR方法克隆了耐高温淀粉酶的结构基因全长1449bp,与pUCm-T载体连接转化入宿主菌DH5α中,经过酶切鉴定筛选出阳性的克隆菌,再提取质粒与表达载体pET-28a(+)酶切后连接转化入宿主菌DE3中,其阳性克隆在37℃1.0mmol/LIPTG诱导下,α-淀粉酶的基因得到了较好的表达.表达产物经SDS-PAGE鉴定,确定表达的蛋白大小为58000Dal左右,与理论推导的分子量相一致;并初步对酶及活性及酶活最适温度和pH进行了研究.

地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)是产生具有重要工业生产价值的耐高温α -淀粉酶(α -amylase)的优良菌株。在提取地衣芽孢杆菌基因组DNA基础上 ,通过PCR方法克隆了耐高温淀粉酶的全长基因1539bp ,与pUCm -T载体连接转化入克隆菌DH5α中 ,经过酶切鉴定筛选出阳性的克隆菌 ,再提取质粒与表达载体pET-28a( +)酶切后连接转化入宿主菌DE3中 ,其阳性重组子在37℃1.0mmol·L-1IPTG诱导下 ,α -淀粉酶的基因得到了较好的表达。表达产物经SDS -PAGE鉴定 ,确定表达蛋白的相对分子量为63000左右 ,与理论推导的分子量相一致。

荞麦淀粉耐高温α-淀粉酶液化工艺条件研究

利用耐高温α-淀粉酶能将底物同步糊化和液化的特性,通过单因素和正交试验对耐高温α-淀粉酶水解荞麦淀粉的动力学参数和最适反应条件进行了测定。结果表明:耐高温α-淀粉酶的最适温度为80～85℃,最适pH为5.0～6.5;该酶水解荞麦淀粉的Km为4.967 4mg/mL,Vm为0.344 8mg/(mL·min);该酶水解养麦淀粉的优化工艺条件为荞麦淀粉浆浓度25%,温度为83℃,pH 6.5,酶用量40 U/g,液化时间15 min。荞麦淀粉液化液糖化后的DE值为89.87%。

耐高温α-淀粉酶高密度高表达发酵条件的优化

通过摇瓶实验对产耐高温α-淀粉酶的重组菌E.coli BL21的高密度高表达发酵条件进行研究。考察不同培养基和不同发酵条件对该菌株产耐高温α-淀粉酶的影响,并利用正交试验进行优化。结果表明:在葡萄糖0.5g/L,酵母粉15g/L,pH6.5,诱导时机为接种后发酵4h,诱导时间为6h,IPTG添加量为0.8mmol/L,接种量为体积分数3%的优化条件下,该重组菌发酵液菌体生物量为原来的1.29倍,酶活力达到8.754U/mL,是原来的1.55倍,目的蛋白的表达量也为原来的1.24倍。

地衣芽孢杆菌WB-11菌株耐高温α-淀粉酶的酶学特性

从地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis )中分离到一α 淀粉酶组分 ,经PAGE及SDS PAGE检测为电泳均一的纯酶蛋白。该酶最适反应温度为 95℃ ,5 0和 70℃条件下酶活性稳定 ,90℃保温 30min残余酶活力为 2 8 9%。该酶最适作用pH为 6 0～ 6 5 ,在pH 5 0～ 8 0内稳定。酶的相对分子质量为 6 5 90 0 ,等电点 6 94 ,对可溶性淀粉的Km 值为 0 4 1mg·mL-1 。Ca2 + 、Mn2 + 、Cu2 + 、Co2 + 及Ba2 + 对酶具有激活作用 ,其中Ca2 + 激活作用最显著 ,且以 4～ 8mmol·L-1 浓度为最适。Ca2 + 还能显著提高酶的热稳定性 ,4mmol·L-1 Ca2 + ,90℃保温 30min ,酶的残余活力提高至 83%。