耐高温-淀粉酶的分子生物学研究进展

耐高温-淀粉酶是应用最广的酶制剂之一,通过分子生物学技术如基因工程开发生产酶制剂是目前常用的生产方法。综述了耐高温-淀粉酶的分子生物学研究进展。

发芽小麦高温α-淀粉酶挤压膨化工艺优化

为解决酿造食品工业中小麦原料还原糖和阿魏酸含量低的问题,利用高温α-淀粉酶挤压膨化处理技术对发芽小麦进行预处理,基于外源酶、内源酶与高温膨化共同作用促进原料中淀粉水解,以期提高其中的还原糖和阿魏酸含量。通过单因素和正交试验,确定最佳工艺条件为物料水分30%、加酶量0.18%、末端机筒温度90℃、螺杆转速80 r/min。在此条件下,还原糖和阿魏酸含量分别为38.39%和3.78 mg/g。与小麦原料和单一发芽处理相比,还原糖含量分别提高481.67%和20.95%,阿魏酸含量分别提高131.90%和38.97%。通过冷场发射扫描电镜(cold field emission scanning electron microscope,Cold FESEM)、傅里叶转换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、高效体积排阻色谱(high performance size exclusion chromatography,HPSEC)表征,观察到发芽小麦的淀粉结构被破坏,其结晶度、短程有序度、重均分子量降低。高温α-淀粉酶挤压膨化处理发芽小麦能够促进还原糖的生成和阿魏酸的释放,为后续发酵食品的生产提供更好的发酵条件和更多的风味前体物质。

耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

高温α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现高温α-淀粉酶基因的高效表达,本研究比较了不同启动子对地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中表达的影响.分别用强启动子P43和地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因自身启动子构建了表达载体pP43NMK-amy和pUBC19-amy,并在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis1A752S中进行表达.结果表明,与地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因自身启动子相比,采用P43启动子的耐高温α-淀粉酶其表达水平提高了8.9倍.而且在枯草芽孢杆菌B.subtilis1A752S中分泌表达的α-淀粉酶仍具有耐高温的特性,酶反应的最适温度为90℃,表明酶的热稳定性由蛋白质本身的氨基酸序列决定的.

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其产物的分泌

以耐高温α 淀粉酶生产菌地衣芽孢杆菌染色体DNA为模板 ,通过PCR扩增耐高温α 淀粉酶基因 ,将扩增产物 1 9kb的DNA片段插入到pUC1 9质粒中 ,再转化大肠杆菌JM1 0 9,通过在淀粉平板上形成透明圈等方法筛选到一株阳性克隆菌株JM1 0 9(pUAM) ,其表达产物可分泌到培养基中 ,除去菌体的发酵液中每 1 0 0mL酶活可达到 2 7个单位。将发酵上清液浓缩后用冷无水乙醇分级沉淀 ,所得样品进行SDS PAGE分析 ,得到分子质量为 60ku的目的蛋白带。

耐高温α-淀粉酶高密度高表达发酵条件的优化

通过摇瓶实验对产耐高温α-淀粉酶的重组菌E.coli BL21的高密度高表达发酵条件进行研究。考察不同培养基和不同发酵条件对该菌株产耐高温α-淀粉酶的影响,并利用正交试验进行优化。结果表明:在葡萄糖0.5g/L,酵母粉15g/L,pH6.5,诱导时机为接种后发酵4h,诱导时间为6h,IPTG添加量为0.8mmol/L,接种量为体积分数3%的优化条件下,该重组菌发酵液菌体生物量为原来的1.29倍,酶活力达到8.754U/mL,是原来的1.55倍,目的蛋白的表达量也为原来的1.24倍。

地衣芽孢杆菌WB-11菌株耐高温α-淀粉酶的酶学特性

从地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis )中分离到一α 淀粉酶组分 ,经PAGE及SDS PAGE检测为电泳均一的纯酶蛋白。该酶最适反应温度为 95℃ ,5 0和 70℃条件下酶活性稳定 ,90℃保温 30min残余酶活力为 2 8 9%。该酶最适作用pH为 6 0～ 6 5 ,在pH 5 0～ 8 0内稳定。酶的相对分子质量为 6 5 90 0 ,等电点 6 94 ,对可溶性淀粉的Km 值为 0 4 1mg·mL-1 。Ca2 + 、Mn2 + 、Cu2 + 、Co2 + 及Ba2 + 对酶具有激活作用 ,其中Ca2 + 激活作用最显著 ,且以 4～ 8mmol·L-1 浓度为最适。Ca2 + 还能显著提高酶的热稳定性 ,4mmol·L-1 Ca2 + ,90℃保温 30min ,酶的残余活力提高至 83%。

荞麦淀粉耐高温α-淀粉酶液化工艺条件研究

利用耐高温α-淀粉酶能将底物同步糊化和液化的特性,通过单因素和正交试验对耐高温α-淀粉酶水解荞麦淀粉的动力学参数和最适反应条件进行了测定。结果表明:耐高温α-淀粉酶的最适温度为80～85℃,最适pH为5.0～6.5;该酶水解荞麦淀粉的Km为4.967 4mg/mL,Vm为0.344 8mg/(mL·min);该酶水解养麦淀粉的优化工艺条件为荞麦淀粉浆浓度25%,温度为83℃,pH 6.5,酶用量40 U/g,液化时间15 min。荞麦淀粉液化液糖化后的DE值为89.87%。

溶氧等参数对耐高温α-淀粉酶发酵的影响

利用耐高温α-淀粉酶的生产菌种—地衣芽孢杆菌IIY-1菌株,对其发酵过程中的各种参数的变化规律与控制方式进行了研究。实验结果表明,采用连续式的pH值的控制方式有利于提高耐高温α-淀粉酶的发酵水平,最后的发酵液的酶活力明显地高于脉动式的pH值控制方式。菌体在产酶阶段对发酵液的溶氧水平要求不高,但是溶氧浓度(DO值)不应低于10%。

耐酸耐高温α-淀粉酶的研究进展

介绍了耐酸耐高温α-淀粉酶在工业生产中具有经济、节能、方便操作等优势;并且概述了耐酸耐高温α-淀粉酶的菌种来源,其中耐酸性α-淀粉酶的菌种主要来源于芽孢杆菌、曲霉以及嗜热真菌;耐高温α-淀粉酶的菌种主要来源于凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和嗜热网络球杆菌等;本文还对耐酸耐高温α-淀粉酶的菌种选育技术方法包括物理方法、化学方法以及基因操作技术等进行了阐述。研究发现对耐酸耐高温α-淀粉酶的发酵工艺进行优化后,最高可以使酶活提高2.1倍;同时在对该淀粉酶的钙离子依赖性进行研究中,得出某些耐酸耐高温α-淀粉酶具有不依赖Ca2+的特性;最后预测人们将会运用基因工程等技术手段,不断地开发出各种特性的耐酸耐高温性α-淀粉酶。

温度和pH值对耐高温α-淀粉酶活力的影响

本文系统的研究了温度、pH值和底物浓度对地衣芽孢杆菌HM - 3产生的耐高温α -淀粉酶酶活力的影响。研究结果表明 :地衣芽孢杆菌HM - 3耐高温α -淀粉酶的最适酶促反应温度为 :75℃ - 85℃之间 ,最适作用的pH值为 :6 .1- 7.0之间 ,该酶用于玉米淀粉的液化其最适底物浓度是 2 0 %～ 2 5 %。

来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达

来源于Pyrococcusfuriosus的耐高温α-淀粉酶是一种重要的酒精工业用酶,在植物中表达耐高温α-淀粉酶可以大大降低用植物秸秆生产酒精的成本。选择衣藻叶绿体基因组同源片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2和壮观霉素抗性基因,构建了来源于Pyrococcusfuriosus的耐高温α-淀粉酶基因的衣藻叶绿体表达载体p64A。通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中,经壮观霉素抗性(100mg/L)筛选,获得了9个抗性衣藻转化子。转化子经过抗性继代筛选后,经PCR、Southernblot检测分析及暗培养,证实耐高温α-淀粉酶基因已整合到衣藻叶绿体基因组中并得到表达。酶活性检测表明,转基因衣藻表达产物具有耐高温α-淀粉酶活性,每克鲜重衣藻最高达77.5u。实验结果证明在植物叶绿体中表达工业酶制剂是可行的。

重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶发酵条件的优化

利用重组毕赤酵母诱导表达可产生耐高温α-淀粉酶,在摇瓶发酵基础上,从诱导时间、甲醇添加量、pH值、接种量4个因素考察发酵条件对耐高温α-淀粉酶酶活力的影响,结合四元线性回归正交试验设计研究方法构建出甲醇诱导重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶的回归模型;优化最佳工艺参数为:诱导时间96h、甲醇添加量0.5%、接种量150mL/100mL、摇床转速200r/min。确定最优工艺条件下,耐高温α-淀粉酶酶活为217.2U/mL。

用耐高温α-淀粉酶构建时间-温度积分器

食品工业杀菌过程中,测量食品内部温度随时间变化的情况对于控制杀菌过程至关重要,时间-温度积分器(TTI)可以指示食品内部温度随时间变化情况。以耐高温α-淀粉酶为指示剂,采用胶囊包埋技术构建TTI,并对该TTI构建指示酶的热失活动力学模型,以魔芋葡聚糖凝胶食品模拟物为载体,用固体食品流态化超高温杀菌装置对该模型进行验证。统计学分析结果表明:耐高温α-淀粉酶的失活遵循一级动力学规律,实验验证结果与TTI构建的模型之间无显著性差异,TTI技术可以用于酶失活动力学的研究,利用耐高温α-淀粉酶构建的TTI能够满足固体食品流态化超高温杀菌时对食品进行时间-温度指示的要求。

耐高温α-淀粉酶的研究进展

耐高温α-淀粉酶是重要的工业用酶制剂之一,本文介绍了耐高温α-淀粉酶的分子结构特点和催化机理及其研究进展。

耐酸耐高温α-淀粉酶及其菌种选育研究进展

耐酸耐高温α-淀粉酶能在高温与低p H下水解淀粉,是重要的新型工业酶制剂。概述了耐酸耐高温α-淀粉酶的热稳定性、p H稳定性及金属离子对其的影响,阐述了产酶菌种的主要来源现状,并重点对耐酸耐高温α-淀粉酶诱变育种的复合诱变、基因工程定点突变等菌种选育和古菌的相关研究进行了综述。

耐高温α-淀粉酶发酵培养基和工艺的优化

通过一系列摇瓶实验,对耐高温α-淀粉酶发酵培养基和发酵工艺进行了优化,在50L全自动发酵罐中进行验证,发酵活力达到14900u/mL,比优化前增加了14%。优化后的培养基和工艺为:白糊精12%,(NH4)2SO40.5%,豆粕粉2%,磷酸盐0.8%;DE20～30,初始pH6.0～6.5。

一种耐高温α-淀粉酶高产菌株的选育方法

以一株产耐高温α-淀粉酶菌株(地衣芽孢杆菌)为出发菌株,经过原生质体制备后由NTG(亚硝基胍)药物诱变,从大量突变株中筛选获得一株高产、稳定的耐高温α-淀粉酶产生菌。摇瓶发酵酶活由选育前的2800u/ml提高到了4100u/m左右,提高了近45%。

海洋耐高温酸性α-淀粉酶水解玉米淀粉的研究

为开发适用于工业生产的新型酶制剂,以实验室自主构建的基因工程菌所产的新型海洋耐高温酸性α-淀粉酶为液化酶,以玉米淀粉液化后的DE值为指标,研究影响玉米淀粉的液化的因素,确定该酶水解玉米淀粉的最佳工艺条件。新型海洋耐高温酸性α-淀粉酶最佳的工艺条件为温度85℃、时间90 min、粉浆浓度250 g/L、酶用量32 U/g淀粉。

耐高温α-淀粉酶液化大米淀粉制取高麦芽糖浆的工艺研究

利用耐高温-α淀粉酶水解大米淀粉制取高麦芽糖浆,对液化过程中的影响因素进行了研究,研究发现液化液的DE值在11%时对制取高麦芽糖浆最有利,其工艺最佳条件为:每1 g淀粉耐高温-α淀粉酶用量为12 U,大米淀粉浆液的质量分数为20%,液化温度为95℃、pH值为6.5、液化时间10 min。

一株耐高温α-淀粉酶产生菌的诱变选育

以一株耐高温α-淀粉酶产生菌DG-4为出发菌株,通过紫外线(UV)诱变,得到菌株DG-4-4,酶活提高了20.4%;通过硫酸二乙酯(DES)诱变,得到菌株DG-4-46,酶活在UV诱变基础上提高了61.9%,比初始出发菌株DG-4提高了95.0%。