树鼩原代耳缘成纤维细胞体外分离培养及鉴定的研究

目的:旨在建立树鼩耳缘成纤维细胞体外分离、培养纯化及鉴定的方法。方法:采用组织块贴壁法进行原代树鼩耳缘成纤维细胞(TSEF)的分离培养,将获得的细胞利用波形蛋白(Vimentin)进行免疫荧光鉴定,RT-qPCR法检测Vimentin基因mRNA的相对表达量;用苏木精—伊红(HE)染色,观察细胞形态;用细胞增殖试剂盒(CCK-8)检测TSEF的增殖情况;利用流式细胞仪检测第3代和第5代细胞周期和凋亡的情况。结果:通过组织块贴壁法可以成功分离出树鼩的耳缘成纤维细胞,在倒置荧光显微镜下原代细胞呈现出长梭形、多触角、鱼群状等形态;细胞免疫荧光Vimentin呈现强阳性;TSEFVimentin mRNA的相对表达量与小鼠3T3 Swiss albino细胞Vimentin mRNA的相对表达量无明显差异(P>0.05)。HE染色结果显示,该细胞形态呈典型的长梭形或星形,细胞质染为淡紫色,细胞核着深紫色,为规则的卵圆形;检测原代细胞增殖情况,细胞增殖曲线呈典型的S形,且第2至第3天是细胞的最佳增殖期。第3代和第5代细胞在G0/G1期所占的比例没有明显地改变(P>0.05),且处于G0/G1期的细胞占主导地位;两代细胞的凋亡率较低且没有明显变化(P>0.05)。结论:组织块贴壁法可成功提取TSEF,且细胞在第3至第5代内生长状况良好,可用于体细胞核移植等科学研究活动。

兰州大尾羊耳缘组织成纤维细胞系的建立

通过物种体细胞培养和长期保存,可在细胞水平上保存珍贵的种质资源。采用组织块培养法培养耳缘组织原代细胞,并通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞并用液氮保存,细胞复苏后进行了活力、形态、生长特性、微生物污染和染色体等检查。结果表明:保存了兰州大尾羊27个个体的耳缘细胞,保存的细胞平均复苏活力97.6%,生长良好,形态呈成纤维型,生长曲线呈"S"型,最大增殖浓度3.01×105个.mL-1,倍增时间为26.1h,细菌、真菌、病毒和支原体检查为阴性,染色体为2n=54,二倍体占88%。最终,成功培养并保存了兰州大尾羊耳缘组织成纤维细胞,使这一珍贵的种质资源在细胞水平上得以长期保存。