银杏叶提取物对放射性损伤耳蜗毛细胞株HEI-OC1增殖、凋亡及Survivin、Bax表达的影响

目的探讨银杏叶提取物(EGB761)对放射性损伤耳蜗毛细胞株HEI-OC1增殖、凋亡及细胞存活素(Survivin)、Bcl-2家族前凋亡蛋白(Bax)表达的影响。方法体外培养耳蜗毛细胞株HEI-OC1,设置正常对照组、放射性损伤组及10 mg/L、20 mg/L、50mg/L、100 mg/L EGB761干预组,除正常对照组外其他组均选择对数生长期HEI-OC1细胞进行照射,建立放射性损伤模型,之后各干预组分别给予相应浓度EGB761进行干预。应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测各组HEI-OC1细胞增殖能力,利用流式细胞仪(FCM)检测各组HEI-OC1细胞凋亡情况,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRTPCR)检测各组细胞Survivin、Bax表达水平。结果 MTT结果显示,与正常对照组比较,放射性损伤组HEI-OC1细胞增殖能力明显下降(P <0. 05);与放射性损伤组比较,EGB761干预组HEI-OC1细胞增殖能力明显上升(P <0. 05),且呈一定剂量依赖性。FCM结果显示,与正常对照组比较,放射性损伤组HEIOC1细胞凋亡率明显增加(P <0. 05);与放射性损伤组比较,EGB761干预组HEI-OC1细胞凋亡率明显降低(P <0. 05),且呈一定剂量依赖性。qRT-PCR结果显示,与正常对照组比较,放射性损伤组HEI-OC1细胞中Survivin水平明显下降(P <0. 05),Bax水平明显升高(P <0. 05);与放射性损伤组比较,EGB761干预组HEI-OC1细胞中Survivin水平明显升高(P <0. 05),Bax水平明显下降(P <0. 05),且呈一定剂量依赖性。结论 EGB761可明显促进HEI-OC1细胞增殖,抑制HEI-OC1细胞凋亡。其作用机制可能为上调凋亡抑制基因Survivin表达及下调凋亡促进基因Bax表达。

胰岛素样生长因子-1抑制庆大霉素引起的小鼠耳蜗毛细胞凋亡

目的探讨胰岛素样生长因子(IGF)-1是否通过Notch信号通路抑制庆大霉素(GM)引起的离体小鼠耳蜗毛细胞凋亡。方法体外培养新生小鼠耳蜗基底膜,在分别含有正常对照培养液(A组)、0.5 mmol/L GM(B组)、0.5 mmol/L GM+10 ng/ml IGF-1(C组)的成分中培养24 h后收集细胞及固定。应用TUNEL法观察各组耳蜗毛细胞的凋亡情况。应用Western印迹、实时定量聚合酶链反应(PCR)观察各组小鼠基底膜Notch2/hes1信号通路的表达量。结果 A组观察到少量凋亡毛细胞,B组耳蜗毛细胞凋亡数量及Notch2/hes1的表达量较A组明显上升(P<0.01),C组细胞凋亡数量及Notch2/hes1的表达量较B组明显下降(P<0.01)。结论 IGF-1通过抑制Notch2/hes1信号通路,减少GM诱导的离体耳蜗毛细胞凋亡。

体外新霉素损伤HEI-OC-1细胞的作用和机制研究

目的目前尚不清楚HEI-OC-1细胞对耳毒性药物的反应和机制是否与耳蜗毛细胞相似。本研究以新霉素为耳毒性药物诱导HEI-OC-1细胞死亡,并探讨新霉素对HEI-OC-1细胞的损伤机制。方法HEI-OC-1细胞培养,加入新霉素诱导死亡,应用光镜、CCK-8检测HEI-OC-1细胞对新霉素的敏感性,应用流式细胞、免疫荧光、qRT-PCR检测HEI-OC-1细胞对新霉素的氧化应激机制。结果新霉素以浓度和时间依赖的方式诱导HEI-OC-1细胞死亡。氧化应激参与了HEI-OC-1细胞的凋亡和坏死。新霉素作用后,HEI-OC-1细胞的抗氧化-促氧化平衡被破坏,促进线粒体ROS积累,诱导MMP丢失,进而诱导HEI-OC-1细胞死亡。这种机制与新霉素在体内的损伤耳蜗毛细胞的机制相似。结论HEI-OC1细胞系可以提供一种细胞模型系统来研究新霉素等耳毒性药物对耳蜗毛细胞的损伤机制。

p27^(Kip1)在不同时期大鼠耳蜗大上皮嵴的表达

目的观察p27Kip1在不同时期大鼠耳蜗的大上皮嵴中的表达情况,探讨p27Kip1在毛细胞分化和再生过程中的作用。方法对胚胎期12天、13天、14天、16天、18天、20天和出生后当天、2天、5天、7天、10天、14天等12个年龄段的大鼠耳蜗进行冰冻切片,然后以1:100抗p27Kip1小鼠单克隆抗体为一抗,1:200异硫氰酸荧光素标记山羊抗小鼠IgG为二抗,进行免疫荧光组织化学检查。结果①胚胎期14天时,p27Kip1开始在蜗管表达,其表达限于原始柯蒂氏器。原始柯蒂氏器中全部细胞均着色。②胚胎期20天左右时,p27Kip1开始在大上皮嵴细胞表达,而在毛细胞中停止表达,但在支持细胞中仍有表达。③出生后7天时,p27Kip1在大上皮嵴的表达达到最强,之后其表达减弱,直至出生后2周时大上皮嵴结构消失。④p27Kip1在耳蜗发育成熟后仍在支持细胞中表达。结论p27Kip1可以作为听感觉上皮的一个标记物。p27Kip1在大上皮嵴细胞中表达,对正常数目毛细胞的产生和耳蜗嵌合体的形成有重要作用。p27Kip1在支持细胞中长期表达是哺乳类毛细胞不能再生的原因之一。

AIFM1基因突变对Harlequin小鼠年龄相关耳蜗听觉功能的影响

目的研究AIFM1基因突变对Harlequin小鼠年龄相关耳蜗听觉功能的影响。方法用圆窗记录耳蜗电图来评价2月龄和6月龄野生型(WT)和AIFM1基因突变型(KO)Harlequin小鼠的耳蜗外周听觉功能,通过Phalloi-din荧光标记耳蜗基底膜外毛细胞的表皮板来评估毛细胞的损失程度。结果 (1)2月龄组WT型和KO型小鼠的复合动作电位阈值分别为18.6±1.6 d B SPL(n=6)和22.2±2.2 d B SPL(n=6),两组之间没有统计学差异(t=1.282,P>0.05);6个月组WT型和KO型复合动作电位阈值分别为25.7±1.7 d B SPL(n=6)和42.1±3.6 d B SPL(n=6),两组之间差异有统计学意义t=4.129,P<0.01)。(2)2月龄组WT型和KO型小鼠CAP的幅值没有统计学差异(P>0.01),而6个月组的CAP的幅值在高频段(30,35和40 k Hz)有统计学差异(Two-way ANOVA,P<0.05),在低频和中频则没有明显差异。2月龄组和6月龄组WT型和KO型小鼠10 k Hz以下CM的幅值的差异没有统计学意义(P>0.05)。(3)耳蜗外毛细胞计数的结果显示,2月龄组的WT型(n=5)和KO型小鼠(n=5)之间没有统计学差异,而6月龄组的KO型小鼠的耳蜗外毛细胞个数在底回较WT型小鼠明显受损(t=15.1,P<0.0001)。结论 AIFM1基因突变导致Harlequin小鼠耳蜗基底膜底回末端外毛细胞受损,从而导致耳蜗外周听觉功能高频段受损。

siRNA抑制GPX1表达对新霉素诱导HEI-OC1细胞凋亡的影响

目的分析抑制谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)对氨基糖苷类抗生素损伤HEI-OC1细胞凋亡的影响。方法首先将HEI-OC1细胞培养后采用免疫荧光法观察GPX1的表达;然后采用CCK8法计算不同浓度新霉素处理HEI-OC1细胞后细胞活力及其半抑制浓度(IC50);再设立对照组和新霉素组,对照组不进行任何处置,新霉素组给予新霉素处理,采用免疫荧光染色、qRT-PCR和Western blot法研究新霉素给药后GPX1的表达;第四步设立空白对照组、阴性对照组和实验组,空白对照组不进行任何处置,阴性对照组转染无意义的siRNA,实验组转染siRNA-GPX1,使用免疫荧光染色、qRT-PCR和Western blot法检测siRNA转染效率,CCK8法观察三组细胞活力变化;转染成功后后两组给予新霉素处理,采用免疫荧光法检测三组细胞活力,并采用免疫荧光染色、TUNEL染色和Western blot法检测三组细胞凋亡状况。结果在HEI-OC1细胞可见中GPX1表达,并且新霉素损伤后HEI-OC1细胞活力随着新霉素的浓度升高而降低,新霉素半抑制浓度为10 mM;新霉素组细胞的GPX1蛋白、mRNA表达水平(分别为0.21±0.07,0.35±0.08)均较对照组(分别为0.38±0.02,1.00±0.16)降低(均为P<0.05)。转染siRNA-GPX1后实验组的GPX1蛋白和mRNA表达水平相对于阴性对照组明显受到抑制,但实验组的细胞活力相对于阴性对照组没有明显变化(P>0.05);给予新霉素损伤后,与阴性对照组细胞计数(301.33±38.76个)比较,实验组的细胞计数(183.67±18.58个)明显减少(P<0.01);实验组TUNEL阳性细胞比例(22.76%±1.66%)高于阴性对照组(10.84%±3.38%)(P<0.01);实验组中Cleaved Caspase-3阳性细胞比例(47.20%±9.22%)高于阴性对照组(14.24%±1.45%)(P<0.001);相对于阴性对照组,实验组BCL-2的蛋白水平下降(P<0.05),BAX的相对蛋白水平升高(P<0.001)。结论抑制氨基糖苷类抗生素损伤毛细胞的GPX1表达可导致HEI-OCI细胞凋亡程度加重,表明GPX1可能具有抗凋亡的作用;GPX1可能成为预防氨基糖苷诱导耳毒性的新潜在靶标。

GATA3对耳蜗发育和功能维持的作用

利用条件性基因敲除方法和免疫荧光技术,检测和分析了小鼠从胚胎到成体耳蜗柯蒂氏器中Gata3的表达.结果表明,Gfi1-cre可以高效敲除特定时期毛细胞内Gata3基因的表达.同时发现成体Gata3-Null的毛细胞数量减少且排列发生紊乱.提示转录因子GATA3在耳蜗毛细胞发育和结构维持中起着重要作用.

甲泼尼龙琥珀酸钠通过Notch2/hes1信号通路减轻庆大霉素致耳蜗毛细胞损伤

目的探究甲泼尼龙琥珀酸钠(MP)对庆大霉素(GM)致耳蜗毛细胞损伤的影响和机制。方法将耳蜗毛细胞随机分为对照组(正常培养状态耳蜗毛细胞)、模型组(3 mmol·L^(-1)庆大霉素)和实验组(3 mmol·L^(-1)庆大霉素和0.2 mg·L^(-1)甲泼尼龙琥珀酸钠)。以CCK-8法检测细胞增殖抑制率,Western blot检测半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Notch2和hes1蛋白的表达。结果模型组和实验组的细胞增殖抑制率在72 h时分别为(33.43±2.17)%和(17.43±4.23)%;对照组、模型组和实验组Caspase-3的相对表达量分别为1.01±0.02,1.79±0.18和1.21±0.14;Notch2的相对表达量分别为1.03±0.05,1.69±0.11和1.15±0.09;hes1相对表达量分别为1.02±0.06,1.58±0.12和1.11±0.07。模型组与对照组相比,实验组与模型组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论甲泼尼龙琥珀可通过下调耳蜗毛细胞Notch2和hes1的表达,促进细胞增殖并抑制细胞凋亡,保护庆大霉素引起的耳蜗毛细胞损伤。

SD大鼠Atoh1基因CDS区的克隆及序列分析

目的利用基因工程方法克隆SD大鼠Atoh1 cDNA编码序列并测定分析其克隆序列。方法采用非对称互补引物/模板法,制备Atoh1 cDNA的编码序列,将其克隆入PMD-19T载体中并测序。结果经酶切鉴定、测序分析表明,扩增得到的大鼠Atoh1基因CDS区全长为1 056 bp,编码351个氨基酸;测定序列与GenBank中公布的参考序列对比,有2处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致。这两处碱基应为单核苷酸多态性(SNP)位点,突变为无义突变,不影响蛋白的表达。结论成功克隆了Atoh1 cDNA编码序列,为进一步对感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础。

Atoh1转录因子在耳蜗内的转译后调节（英文）

Atoh1属于bHLH转录因子家族成员,其对耳蜗毛细胞的胚胎发育及损伤后再生具有重要作用。许多讯号通道在转录水平上对Atoh1有调节作用,包括Notch和Wnt通道。在蛋白转译后水平,Atoh1是经由泛素-蛋白酶通道所调节。体外细胞实验及体内动物实验都显示:经由上述讯号通道的调节手段不仅影响耳蜗发育,也导致毛细胞的损伤后再生。本综述回顾了耳蜗内各个对Atoh1调节讯号通道研究的进展,并聚焦于泛素-蛋白酶通道对Atoh1进行转译后调节及其对毛细胞发育的影响。

内皮素在噪声性内耳损伤过程中的作用

目的研究噪声性内耳损伤过程中耳蜗微循环的病理变化以及内皮素(endothelin,ET)在这一病理过程中的作用及意义。方法30只大鼠按电脑产生随机数字法分为5组:对照组、噪声暴露(115dB白噪声每天8h)1、4、8和15d组。分别用扫描电镜观察毛细胞的形态,血管纹铺片观察耳蜗微循环的状态,放射免疫方法检测血浆ET含量,免疫组化染色观察ET1、ETA、ETB的分布。结果噪声4、8、15d组出现了血管纹明显缺血,外毛细胞形态异常。血浆ET于4d组出现暂时性升高。ET1于耳蜗组织中有广泛的阳性表达,噪声暴露前后差异无统计学意义;ETA主要分布于血管纹中间细胞与微血管壁周围的细胞,对照组与1d组表达呈弱阳性(+),噪声4、8、15d组表达呈强阳性(+++)。ETB主要分布于血管纹毛细血管内皮细胞,其变化趋势与ETA相似。结论噪声性内耳损伤过程中出现了明显的耳蜗微循环障碍,同时大鼠耳蜗组织的ET系统活性增高,二者在时间上有明显的一致性。推测噪声所致的耳蜗微循环障碍过程中ET起了重要的介导作用。