不同培养基对耶氏解脂酵母合成共轭亚油酸的影响

为了提高共轭亚油酸(CLA)在耶氏解脂酵母重组菌株中的产量,选择YEA、YPD、YP2D4、YNBDO2和YNBDL25种培养基,对其进行摇瓶发酵,分析其生长状态,并利用气相色谱法测定菌体中的总脂含量及脂肪酸组成。结果表明:培养基中充足的碳源和氮源是提高菌体生物量及重组蛋白表达量的前提;在培养基中添加脂肪酸显著提高了菌体中的总脂含量和t10,c12-CLA产量;在5种培养基中,YNBDL2是最适合t10,c12-CLA合成的培养基,其培养基中t10,c12-CLA产量为185.8 mg/L,是YPD培养基中t10,c12-CLA产量的13倍。

共轭亚油酸合成相关基因在耶氏解脂酵母中异源表达及活性研究

为了探究植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中与共轭亚油酸(CLA)生物合成相关的3个基因:(亚)油酸水合酶基因(mcra)、短链脱氢酶/氧化还原酶基因(dh)、乙酰乙酸脱羧酶基因(dc)在耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica,Y.lipolytica)中异源表达后能否具有活性,利用两个耶氏解脂酵母整合表达质粒(p INA 1269和p INA 1312),将3个基因分别导入耶氏解脂酵母营养缺陷型宿主菌Polf(Ura^-,Leu^-)中,构建了重组菌株。在不同重组菌中添加相应的底物:亚油酸(LA)和10-羟基-顺12-十八碳烯酸(10-HOE),然后对反应体系进行脂肪酸检测,得到基因对应的不同产物:10-HOE和10-氧代-反11-十八碳烯酸(10-oxo-trans 11-octadecenoic acid),证明mcra、dh、dc在耶氏解脂酵母中进行了异源表达并且具有活性。

溶氧对耶氏解脂酵母油脂积累和柠檬酸分泌的影响

产油耶氏解脂酵母能将培养基中过量的碳源转化为油脂储存于细胞内并分泌大量的柠檬酸。在耶氏解脂酵母发酵过程中通过关联搅拌转速和通气量调控培养基中的溶氧含量处于5%、10%、20%、30%和不控制5种水平,来研究溶氧对其油脂积累和柠檬酸分泌的影响。结果表明,随着发酵培养基中溶氧的增加,耶氏解脂酵母细胞内油脂含量和柠檬酸分泌量均有所增加,且不控制培养基中溶氧时,细胞内油脂含量和柠檬酸产量均最高,油脂含量达到细胞干重的11.62%(w/w),柠檬酸产量达到21.0 g/L。培养基中不同的溶氧含量还会影响油脂的脂肪酸组成,高溶氧能够促进油酸含量的增加,溶氧不控制时油酸的含量最高,达到48.62%。本研究为耶氏解脂酵母产脂发酵培养过程中溶氧的控制提供了重要的实验依据。

重金属离子对耶氏解脂酵母油脂积累量及柠檬酸分泌量的影响

通过研究不同种重金属离子对生物量、细胞外柠檬酸含量、油脂含量及脂肪酸组成的影响,进一步探究不同浓度梯度下的金属离子对耶氏解脂酵母油脂积累量和柠檬酸分泌量的影响。结果表明,4种金属离子(Co^2+、Cu^2+、Mn^2+、Ni^2+)均能抑制耶氏解脂酵母细胞的生长,且随着浓度的增加抑制作用更加明显;其中Mn^2+能够促进细胞柠檬酸分泌和油脂积累,油脂积累量和柠檬酸分泌量分别在1.0和2.0 mmol/L Mn^2+时达到最大值,分别为17.6%(w/w)和6.9 g/L;其他3种金属离子则抑制柠檬酸分泌和油脂合成;Co^2+、Ni^2+、Cu^2+影响脂肪酸组成,Co^2+和Ni^2+促进了饱和脂肪酸含量增加,单不饱和脂肪酸的含量急剧下降,而Cu^2+则促进脂肪酸不饱和度的增加,亚油酸的含量从7%提高到40%以上。本研究首次探究了金属离子对耶氏解脂酵母微生物油脂积累和柠檬酸分泌的影响,为产油微生物油脂发酵生产提供有力的依据。

解脂耶氏酵母细胞工厂生产多不饱和脂肪酸的研究进展

多不饱和脂肪酸属直链脂肪酸,是机体生物膜的关键结构组分,它可以调控糖脂代谢及激素代谢,具有促进发育、提高免疫力和预防疾病等多种益生功能,对机体健康具有十分重要的作用。因此,多不饱和脂肪酸在食品、医药和饲料等多个领域均表现出重要的应用价值和广阔的开发前景,市场需求持续上升。与传统的海洋生物提取法相比,微生物合成法具有生产周期短、工艺简单、对环境友好等优势,近年来利用微生物细胞工厂生产多不饱和脂肪酸等微生物油脂逐渐成为科学界和工业界的研究热点和发展趋势。解脂耶氏酵母作为一种非常规产油酵母,因其具备高产油脂和脂肪酸的天然能力,因此成为了代谢工程改造微生物生产多不饱和脂肪酸的首选底盘细胞之一。本文首先介绍了多不饱和脂肪酸的来源及其天然合成途径;然后总结归纳了当前利用代谢工程策略改造解脂耶氏酵母生产多不饱和脂肪酸的研究现状;最后对利用解脂耶氏酵母细胞工厂生产多不饱和脂肪酸存在的主要瓶颈问题和未来发展趋势进行了探讨,期望为未来高效合成多不饱和脂肪酸微生物细胞工厂的构建提供理论支持与思路。

1例脑脊液二代测序检出解脂耶氏酵母菌病例分析

宏基因组二代测序(mNGS)技术的广泛应用使临床罕见病原学检出率增加。解脂耶氏酵母菌是一种罕见的机会性致病真菌,主要引起院内导管相关性感染。目前有关于脑脊液mNGS检出解脂耶氏酵母菌及其引发颅内感染的临床资料有限。本文报道了1例神经外科术后颅内感染脑脊液mNGS检出解脂耶氏酵母菌的病例。临床药师参与患者抗感染治疗并给出药学监护建议。患者仅接受抗细菌治疗及腰大池脑脊液引流,未行抗真菌药物治疗,最终治疗成功。本案例补充了脑脊液mNGS检出解脂耶氏酵母菌的临床资料。

ARTP和NTG诱变选育的解脂耶氏酵母对酸肉风味的影响

采用常压室温等离子体(ARTP)和亚硝基胍(NTG)诱变技术处理解脂耶氏酵母C11,研究诱变前、后菌株的酶学性质。最终筛选出4株突变菌A6、A13、A14、N12,酶活分别为1.007,1.554,1.139,1.021 U/mL,是起始菌株的1.41,2.17,1.59,1.43倍。4株突变株的最适温度为50℃、最适pH值为8.0。乙醇对脂肪酶酶活有抑制作用,最适底物由C8酯变化为C4酯。将A13、N12接种到酸肉发酵中,采用固相微萃取结合气相色谱-质谱法测定样品中挥发性物质,结果表明接种突变株能很好地改善酸肉的感官品质,促进酯类、醛类、醇类等挥发性风味物质的产生,显著提高丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、庚醛、壬醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛和1-辛烯-3-醇的气味活性值(OAV),赋予酸肉玫瑰香味、蘑菇味、焦香味、水果味等风味。

解脂耶氏酵母产赤藓糖醇研究进展

赤藓糖醇是一种天然甜味剂,因具有热量低、稳定性好、食用安全性高等优点,被广泛应用于食品、医药及化工等行业。解脂耶氏酵母作为赤藓糖醇的高效发酵菌株,被广泛用于赤藓糖醇的工业生产中。但目前解脂耶氏酵母生产赤藓糖醇的相关研究主要集中于发酵过程控制与代谢途径调控等方面,还存在产量与技术上的瓶颈。基于此,本文从发酵基质利用、发酵过程控制及基因工程改造代谢途径3个方面对解脂耶氏酵母生产赤藓糖醇的国内外研究进展进行综述,以期为日后突破解脂耶氏酵母产赤藓糖醇的产量与技术瓶颈提供参考依据。

解脂耶氏酵母底盘细胞的工程改造及应用

基于性能卓越的微生物底盘细胞,开发高效的绿色生物制造技术,已经成为合成生物学领域的研究前沿。解脂耶氏酵母作为一种非常规产油酵母,由于其独特的生理生化特征,正迅速成为面向绿色生物制造的合成生物学研究领域的热门底盘细胞之一。近年来,围绕解脂耶氏酵母底盘细胞工程改造的研究与应用日益增多,促进了解脂耶氏酵母底盘细胞的进一步升级。本文总结了针对解脂耶氏酵母底盘细胞的工程改造策略及其在生物制造中的应用,从遗传改造技术及工具开发,基因的表达与调控策略等方面介绍各类合成生物学工具及技术在解脂耶氏酵母中的研究进展,并从底盘细胞合成高附加值产品的研究进展方面介绍了其工程改造效果。最后,对解脂耶氏酵母底盘细胞的应用前景和未来发展方向进行了展望。

代谢工程构建重组耶氏解脂酵母生产中长链聚羟基脂肪酸酯

中长链聚羟基脂肪酸酯(mcl-PHA)是一大类由微生物合成的天然生物聚酯,因具有可再生性和生物降解性越来越受到人们的关注。Mcl-PHA可由一些假单胞菌类利用自身的脂肪酸合成途径或β-氧化途径来合成。耶氏解脂酵母具有很好的脂/脂肪酸分解代谢能力,但是它体内缺乏PHA合成酶不能合成mcl-PHA。采用代谢工程策略构建重组解脂酵母,外源表达来自铜绿假单胞菌PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1)的PHA合成酶。在PHA合成酶的C端添加PTS1过氧化物酶体定位信号序列,使其在过氧化物酶体内发挥功能,并对其编码基因Pha C1进行密码子优化得到o Pha C1。利用p INA1312载体构建表达框,借助载体上的zeta序列元件将o Pha C1基因表达框整合至酵母基因组,完成基因的稳定表达。重组菌PSOC在葡萄糖为唯一碳源的培养基中几乎不产PHA,添加0.5%的油酸时可合成占细胞干重0.67%的mcl-PHA。在含三油酸甘油酯的培养基中发酵72h产生1.51%mcl-PHA(wt%)。实验结果充分证明重组解脂酵母作为有潜力的微生物细胞工厂可以用于生产mcl-PHA,也为将来利用富含油脂和其他营养的餐厨垃圾水解液等廉价资源生产mcl-PHA打下基础。

解脂耶氏酵母菌处理含油废水的研究

利用解脂耶氏酵母菌在最佳降解条件下分别处理色拉油、餐饮油等油脂类废水和柴油、机油等石油类废水50h．结果表明：该菌株能快速降解油脂，在油质量浓度≤2000mg／L时生化反应属于一级反应，对色拉油、餐饮油中油脂的降解率分别为93．30％和85．08％，同时菌体细胞大量生长，其生物量分别为1652．7和1940．0mg／L，废水处理过程中pH稳定在3—4之间；但该菌对石油的降解率低，生成的生物量少，处理后废水pH维持在6～7之间．解脂耶氏酵母菌对油的降解与自身生物量的生成有关，该菌株降解油脂类和石油类物质的途径不同，产生的脂酶系统不同，使得废水的pH变化规律不相同．

利用a凝集素在酿酒酵母表面展示解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2

【目的】将解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2展示在酿酒酵母表面,构建全细胞催化剂。【方法】采用PCR方法扩增得到解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2成熟肽编码基因LIP2,将其连接到AGA2基因的下游构建表面展示载体pCTLIP2。分别以橄榄油、三丁酸甘油酯和对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)为底物检测展示的脂肪酶酶活。在此基础上,对野生菌及工程菌的酶学性质进行比较。【结果】展示Lip2的酿酒酵母重组菌株在半乳糖的诱导下,表现出水解橄榄油、三丁酸甘油脂以及pNPP的活性,20℃诱导72h时酶活达到最高,为182U/g干细胞。对展示的Lip2的酶学性质研究表明,其最适温度为40℃,最适pH为8.0,温度稳定性比自由酶有所提高,50℃温浴4h后残余酶活为其最大酶活的23.2%。以不同碳链长度的对硝基苯酚酯为底物检测其底物特异性,结果显示其水解C8,C12,C16对硝基苯酚酯活性相近,均远高于对硝基苯酚丁酸酯(C4)的水解酶活。【结论】对于Lip2,a凝集素系统是一个有效的展示系统,利用该系统成功将Lip2展示在酿酒酵母表面,从而构建了酿酒酵母全细胞催化剂,该全细胞催化剂具有良好的潜在应用前景。

解脂耶氏酵母表达系统研究进展

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是非常规酵母中具代表性的一种,它底物广泛,尤其能利用有机酸(柠檬酸、异柠檬酸),蛋白类(蛋白酶、脂肪酸、酯酶、磷酸酶、α-甘露糖苷酶、RNase)。烷烃类廉价物质作为底物分泌大量的代谢产物,自上世纪40年代被发现以来,越来越受到研究者的重视,并于上世纪90年代被开发成为一种新的酵母表达系统,用于42种异源蛋白的高效表达。综述了解脂耶氏酵母表达系统及其特点,有利于研究者从转录和翻译的水平研究异源蛋白在此菌中的表达分泌路径以及寻找到调控型启动子。

解脂耶氏酵母处理含油废水的工艺条件

采用正交实验方案筛选解脂耶氏酵母处理机油、柴油废水的最佳条件，发现在温度为25～30℃、pH6—7、培养时间50h、摇床转速200r／min的条件下，解脂耶氏酵母对上述废水的处理效果最佳，与我们过去报道的处理色拉油的最佳条件相同。在该条件下，利用解脂耶氏酵母分别处理机油、柴油、色拉油、餐饮油废水，结果表明：解脂耶氏酵母对各种含油废水均具有一定的降解能力，且对油脂废水的降解效率高于石油废水。当油浓度≤2000mg／L时，解脂耶氏酵母对机油、柴油废水、色拉油和餐饮油废水的降解率分别为22．93％、13、26％、93．30％和85．08％。

固定化解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)处理油脂废水的性能研究

以海藻酸钠为固定化载体材料，以氯化钙作为交联剂，将高效降解油脂菌——解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytico）包埋制备成固定化微生物小球，用以处理油脂废水，考察了最佳处理条件。结果表明，解脂耶氏酵母经固定化包埋后处理色拉油废水的最适条件为：温度25～35℃、pH4～8、摇床转速100—200r／min，处理初始油浓度在2000mg／L，包埋菌浓度6．65×10^6个／mL，包埋量为4mL／150L。与悬浮状态相比，固定化微生物温度适应范围增大、热适应性增强、pH值往酸性方向偏移。将固定化解脂耶氏酵母投入YPD液体培养基内驯化30h再处理色拉油废水，结果显示：驯化后的固定化微生物在同样条件下对色拉油的降解率达到82％，比未驯化状态高20％，且驯化后的机械强度、稳定性和重复使用性都有明显改善。

壳聚糖酶基因在解脂耶氏酵母中的表达及重组酶性质研究

为构建高效表达壳聚糖酶工程菌株,以Microbacteriumsp.基因组为模板扩增壳聚糖酶基因,目的基因与表达载体pINA1317连接构建重组质粒,重组质粒NotⅠ酶切线性化后转化解脂耶氏酵母Y.liPolytica Po1h。所得结果为PCR扩增得到约1000bp的特异性片段,序列分析表明含有壳聚糖酶全长基因,开放阅读框801bp,编码266个氨基酸残基。转化子酶活力为10.4U/mL,是原菌株酶活力的3.15倍。重组蛋白经DEAE-Sepharose FF分离纯化,达到电泳纯,SDS-PAGE显示单一条带,分子量约41kDa。重组酶反应最适温度为45℃,最适pH为5.6,Km和Vmax分别是0.926mg/mL和6.15U/mL。质谱分析酶解产物主要为三糖和五糖。实现了壳聚糖酶在解脂耶氏酵母中的分泌表达,为壳聚糖酶的工业化生产奠定了理论基础。

不同碳源培养下解脂耶氏酵母的转录组差异分析

以葡萄糖为碳源生长的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)为对照组,以油酸为碳源生长的Y.lipolytica为实验组,利用Illumina高通量测序平台对两者进行转录组测序,通过多种生物信息学方法对数据进行分析处理.对照组的测序结果共得到17923921 clean reads;实验组的测序结果共得到22656852 clean reads.两个样品差异表达基因的分析显示共有536个显著性差异表达基因,376个基因表达上调,160个基因表达下调.通过GO和KEGG富集分析可以了解这些差异基因参与的生物学调控.本研究为解脂酵母分子生物学的进一步研究提供了参考.

解脂耶氏酵母处理高浓度色拉油废水

解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)对色拉油废水具有降解能力,实验研究了影响降解率的相关因素。结果表明,该菌在pH6-7、温度为25-30℃、摇床转速200r/min、废水中油脂起始浓度≤2000mg/L的条件下,对废水中的色拉油具有较高的降解率,最高可达95.59%。

固定化解脂耶氏酵母处理油脂废水研究

利用海藻酸钙包埋固定的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)分别降解以色拉油为惟一碳源和以葡萄糖为惟一碳源的污水,结果表明,在最佳处理条件下,固定化细胞在50 h内,能较好地降解废水中浓度为2000 mg/L的色拉油和浓度为2000 mg/L的COD,降解率都在80%以上;固定化细胞对色拉油、COD降解效率随着时间的延长而增加、随着底物浓度的增加而下降;与未固定菌株相比,固定化细胞有着更好的储存稳定性和可重复使用性,结果进一步提示固定化解脂耶氏酵母适于含油废水以及高COD含量的生活污水处理。

食品检验用解脂耶氏酵母菌标准物质制备研究

目的制备解脂耶氏酵母菌检验用标准物质,以满足实验室酵母菌日常检验质量控制及实验室间比对需求。方法通过生化、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)及转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)位点测序,对研究用菌株进行菌种鉴定确认后冻干,制备10^(4)CFU/样品浓度的标准物质。参照CNAS—GL003:2008《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》等的要求进行均匀性检验后,采用单因素方差分析对结果进行评价。样品放于-20、4、25和37℃条件下,分别进行运输稳定性检验及储存稳定性检验。依据GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》,验证标准物质在真实食品样品中适用性。结果CMCC98025经生化鉴定为解脂耶氏酵母菌,准确度为93%;MALDI-TOF MS鉴定结果为解脂耶氏酵母,分数为2.012;ITS位点测序与美国国家生物信息中心基因库中序列比对,匹配最优结果为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。均匀性测试结果符合正态分布,F0.05(19,20)=2.137,F=1.697<F0.05,符合均匀性要求。25及37℃中放置7 d稳定,标准物质中菌含量仍保持在10^(4)CFU/样品;4℃储存28 d及-20℃储存90 d,菌含量为10^(4)CFU/样品,复苏率均在91%以上。本标准物质加入7类食品样品基质均可检出,回收率为81.3%。经3家实验室协作标定,本标准物质平均浓度为2.0×10^(4)~3.0×10^(4)CFU/样品。结论本研究制备的解脂耶氏酵母菌标准物质均匀性、稳定性、真实食品样品中应用验证及协作标定结果均符合要求,可应用于食品中解脂耶氏酵母菌检验。