结核分枝杆菌EsxV/W融合蛋白对耻垢分枝杆菌表型及巨噬细胞功能的影响

目的:构建表达结核分枝杆菌EsxV/W融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(MS),分析重组MS的表型及对巨噬细胞功能的影响。方法:原核表达获取EsxV/W融合蛋白,纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体;电击转化法构建重组菌株MS-EsxV/W及空载菌株MS-vec,使用制备的多克隆抗体检测融合蛋白在MS中的表达;分析表达EsxV/W融合蛋白的重组MS的菌落形态、生物膜及生长速率;菌落计数法检测重组MS在溶菌酶、孔雀绿、低pH、SDS、H2O2、NaNO2等不同环境条件下的存活能力,分析EsxV/W融合蛋白对MS表型的影响;重组MS侵染ANA-1巨噬细胞,Griess法检测ANA-1细胞NO的释放量,酶联免疫吸附实验检测ANA-1细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6(IL-6)的释放量,菌落计数法检测重组MS在ANA-1细胞内的存活能力。结果:成功构建能表达EsxV/W融合蛋白的重组菌株MS-EsxV/W,表达EsxV/W融合蛋白对MS的菌落形态、生物膜形成及生长速率无显著影响;表达EsxV/W融合蛋白不改变MS对溶菌酶、孔雀绿与低pH的耐受力,但可降低对SDS的耐受力,增强对H2O2与NaNO2的耐受力;侵染ANA-1细胞一定时间后,与MS-vec比较,MS-EsxV/W侵染的ANA-1细胞NO、TNF-α、IL-6释放量明显增加,且MS-EsxV/W的细胞内存活能力高于MS-vec。结论:EsxV/W融合蛋白可改变MS的表型并调控ANA-1巨噬细胞的免疫应答反应,有助于后续对esxV/W基因功能的探究。

病原微生物高通量测序检测确诊耻垢分枝杆菌感染1例

耻垢分枝杆菌属于Ⅳ型(快速生长型)非结核分枝杆菌,广泛分布于自然环境中,可以在皮肤黏膜正常存在,当机体免疫力下降或正常皮肤黏膜破损时可成为条件致病菌。耻垢分枝杆菌感染相关病例报道甚少,发病率低,临床上容易出现漏诊。应用病原微生物高通量测序技术(NGS)对感染性疾病的病原体筛查能更早期发现病原体,达到早诊断、早治疗的目的,极大提高了疑难性感染性疾病的诊断率。本文通过血液NGS检测确诊1例耻垢分枝杆菌感染病例进行报道并文献复习,拟提高对耻垢分枝杆菌感染的诊治水平。

结核分枝杆菌PE22/PPE36融合蛋白对耻垢分枝杆菌表型及巨噬细胞功能影响的研究

目的将结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)PE/PPE家族重组融合蛋白PE22/PPE36异源表达于耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms)后,探讨其对Ms表型及巨噬细胞功能的影响,分析其在Mtb感染过程中发挥的作用。方法原核表达获取融合蛋白PE22/PPE36,纯化后免疫6~8周龄小鼠制备多克隆抗体;电击法构建重组菌Ms_PE22/PPE36及Ms_vec,并用所制备的多克隆抗体验证重组融合蛋白在Ms中的表达。将重组菌接种于2×YT培养基中观察其菌落形态及生长曲线;点板法及菌落计数法检测重组菌在H_(2)O_(2)、SDS、溶菌酶、NaNO_(2)、低pH、饥饿等压力条件下的存活情况,以分析PE22/PPE36融合蛋白对Ms表型的影响;重组菌侵染巨噬细胞ANA-1及RAW 264.7后,流式细胞术检测ANA-1细胞凋亡率,ELISA法检测ANA-1细胞TNF-α及IL-6分泌量,Griess法检测ANA-1及RAW 264.7细胞NO分泌量并用通道抑制剂检测所涉及的通路,菌落计数法检测重组菌在ANA-1及RAW 264.7细胞内的存活情况。结果与Ms_vec组相比,Ms_PE22/PPE36的菌落形态、生物膜形成及在溶菌酶、NaNO_(2)、低pH等压力条件下的存活率差异无统计学意义(溶菌酶:t 3 h=0.082,t 6 h=0.174,t 9 h=0.355;NaNO_(2):t 3 h=0.950,t 6 h=1.274;低pH:t 3 h=1.869,t 6 h=1.119,t 9 h=0.091;均P>0.05);在H_(2)O_(2)、SDS压力条件下存活率明显降低(H_(2)O_(2):t 6 h=4.35,t 8 h=4.80;SDS:t 4 h=10.43,t 6 h=2.793;均P<0.05);而稳定期生长速率及在饥饿压力条件下的存活率明显增高(生长速率:t 30 h=5.39,t 36 h=2.55,t 42 h=3.48;饥饿:t=3.323;均P<0.05);与Ms_vec感染组相比,Ms_PE22/PPE36组ANA-1细胞的早期凋亡率及TNF-α分泌量明显增加(早期凋亡:F=4.765;TNF-α:t 24 h=26.642,t_(48)h=7.634;均P<0.05),IL-6分泌量明显减少(t 24 h=5.888,t_(48)h=3.001;均P<0.05),ANA-1及RAW264.7细胞NO分泌量明显增加(ANA-1:F_(12)h=163.267,F_(24)h=111.530,F 48 h=500.328;RAW 264.7:F_(12)h=133.202,F_(24)h=718.436,F 48 h=1434.9;均P<0.05),且可被通道抑制剂Bay 11-7082、U0126及SB203580明显抑制(ANA-1:t NF-κB=32.074;t ERK=11.679;t p38=16.840;RAW 264.7:t NF-κB=119.112;均P<0.001);与Ms_vec相比,Ms_PE22/PPE36在ANA-1细胞内的存活率无明显变化(t_(48)h=0.327,t_(72)h=1.933,均P>0.05),在RAW 264.7细胞内的存活率明显降低(t_(48)h=5.509,t_(72)h=5.417;均P<0.05)。结论重组融合蛋白PE22/PPE36可改变Ms的表型并调控巨噬细胞的免疫应答。

结核分枝杆菌Rv3737抑制巨噬细胞自噬促进耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活

目的了解结核分枝杆菌跨膜蛋白Rv3737对耻垢分枝杆菌感染巨噬细胞自噬的作用。方法通过PCR扩增结核分枝杆菌Rv3737目的基因,T4连接酶连接Rv3737及穿梭质粒pMV261,构建pMV261-Rv3737,双酶切及测序验证pMV261-Rv3737,通过电转将pMV261-Rv3737及pMV261-Vector电转至耻垢分枝杆菌感受态细胞中以构建过表达Rv3737的耻垢分枝杆菌菌株(MS::pMV261-Rv3737)和对照菌株(MS::pMV261),PCR及Western blot验证过表达Rv3737的耻垢分枝杆菌菌株。利用分光光度计检测OD600评估过表达Rv3737对耻垢分枝杆菌体外生长的影响。将MS::pMV261-Rv3737及MS::pMV261感染巨噬细胞,通过菌落形成单位(CFU)计数检测耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活,用Western blot及激光共聚焦检测自噬相关蛋白LC3II的变化。结果Rv3737不影响耻垢分枝杆菌的体外生长,但促进耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活,过表达Rv3737明显抑制LC3II的表达,激光共聚焦结果显示过表达Rv3737后LC3II自噬点明显减少。结论结核分枝杆菌跨膜蛋白Rv3737可能通过抑制巨噬细胞自噬来促进耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活,有望成为抗结核药物作用的靶点,为结核病的治疗提供一定的理论依据。

Sigma因子E(SigE)在耻垢分枝杆菌中抗DNA损伤并参与DNA损伤修复调控

目的 探讨Sigma因子E (SigE)在耻垢分枝杆菌(MS)中抗DNA损伤的作用及其参与的DNA损伤修复调控机制。方法 克隆耻垢分枝杆菌SigE基因到质粒pMV261构建重组pMV261(+)-SigE质粒,插入序列测序验证。重组质粒被电转化入耻垢分枝杆菌构建SigE过表达菌株pMV261(+)-SigE/MS,Western blot法检测SigE的表达。含pMV261质粒的耻垢分枝杆菌作为实验的对照菌株。培养菌株,测定吸光度(A600)值监测两组菌株的生长差异。通过菌落形成单位(CFU)计数法检测两种菌株在紫外线、顺铂(DDP)和丝裂霉素C(MMC)三种DNA损伤剂作用下的存活率差异。通过生物信息学分析分枝杆菌DNA损伤修复通路并筛选SigE相关基因,实时荧光定量PCR法检测这些基因在两种菌株的表达差异,探究SigE抗DNA损伤的可能机制。结果 成功构建SigE过表达菌株并检测到SigE在耻垢分枝杆菌表达;与对照组相比,SigE过表达组生长较缓慢,更晚进入生长平台期;生存率分析发现过表达菌株对紫外线、 DDP、和MMC三种DNA损伤剂更耐受;生物信息学分析SigE基因与DNA损伤修复基因重组酶A(recA)、单链DNA结合蛋白(ssb)、易错DNA聚合酶(dnaE2)密切相关;DNA损伤剂处理下,SigE过表达菌株的recA、 dnaE2、 ssb等基因的表达水平比对照组均有不同程度的升高。结论 SigE在耻垢分枝杆菌抗DNA损伤中发挥重要作用,其机制与分枝杆菌的DNA损伤修复调控密切相关。

无细胞耻垢分枝杆菌疫苗的Ⅰ期临床研究

目的:通过Ⅰ期临床研究探讨无细胞耻垢分枝杆菌疫苗(M.S疫苗)的人群安全性和耐受性,并初步观察该疫苗对结核病高危人群皮试反应强度的影响。方法:给55例健康志愿者注射不同剂量的疫苗(8.7,17.5和35.0μg),每例注射6次,每2周注射1次。通过对受试者的随访、心率和血压测试、血液常规、尿液常规、肝功能、胸部X-片以及肝、胆、脾、胰的B超检查以及PPD皮肤试验,评估M.S疫苗的不良反应,并比较疫苗注射前后PPD反应强度的变化。结果:在55例、330例次M.S疫苗注射过程中,发生14例、17例次的轻度不良反应,包括局部疼痛、淋巴结肿大、发热、局部硬结、心慌、皮疹和乏力,轻度不良反应总发生率为25.5%(14/55),未发生中度及重度不良反应;PPD皮试强阳性者经不同剂量M.S疫苗的注射,PPD皮试反应强度均显著降低(P<0.05)。结论:M.S疫苗具有较高安全性,并可显著降低结核病高危人群PPD皮试反应的强度。

绿茶粗提物对耻垢分枝杆菌的生长抑制研究

采用乙酸乙酯在中性条件下萃取绿茶,得到含有表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)的粗提物。通过纸片琼脂扩散法和细菌生长曲线来评价绿茶粗提物对耻垢分枝杆菌的抑菌效果,利用透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察其对耻垢分枝杆菌细胞壁结构的影响。结果显示,绿茶粗提物对耻垢分枝杆菌生长产生明显抑制作用,且抑菌作用随着浓度的升高逐渐加强;经绿茶粗提物处理的耻垢分枝杆菌细胞壁呈现膨出、变形等形态学变化。因此,绿茶粗提物具有抑制耻垢分枝杆菌生长的功能,其作用机制可能与其主要成分EGCG影响细胞壁肽聚糖的生物合成有关。

弓形虫GRA4基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白4(GRA4)基因,构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-GRA4,重组耻垢分枝杆菌,鉴定重组蛋白的抗原性。方法用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因,克隆入pGEM-T载体,然后亚克隆法构建ps3000-GRA4大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将GRA4基因片断的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatismc2155)中,用重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠,Western blot方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体。结果成功扩增了弓形虫的GRA4基因并构建克隆质粒pGEMT-GRA4、穿梭质粒ps3000-GRA4,Western blot分析显示,GRA4重组蛋白能被重组质粒免疫小鼠血清识别,分子质量单位约为40.0 ku。结论重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白GRA4,具有抗原性,刺激小鼠机体产生了抗弓形虫的抗体,为弓形虫重组BCG(Bacillus Calmette-Guerin)疫苗的研究奠定了基础。

表达人幽门螺杆菌外膜蛋白的穿梭质粒的构建及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的建立表达人幽门螺杆菌外膜蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础。方法利用聚合酶链反应(Polymerasechainreaction,PCR)扩增的幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因全长片段,克隆入pET32a(+),鉴定无误后,再亚克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pLA71,构建pLA71-omp载体,将pLA71-omp电转化耻垢分枝杆菌,经卡那霉素筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定,Westernblot检测omp的表达及活性。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出约528bp的基因片段。所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致,测序结果确证了插入片段的正确性,Westernblot检测说明幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。结论成功构建了幽门螺杆菌外膜蛋白528编码基因大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒。该质粒能在E.coli/MS间进行穿梭,并在耻垢分枝杆菌中表达。

耻垢分枝杆菌黏膜接种对小鼠过敏性哮喘的免疫调节作用

目的观察耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms)对过敏性哮喘小鼠防御素β-2(Defb2)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)、IFN-γ、IL-4及过敏原特异性IgE、IgG1、IgG2a表达的影响,探讨Ms黏膜接种干预哮喘的免疫调节机制。方法 SPF级BALB/c小鼠随机分为哮喘组、干预组、对照组3组。以卵清蛋白(OVA)致敏,气道激发建立哮喘模型。OVA致敏前7 d鼻黏膜接种Ms进行干预。以Real-time荧光定量PCR法检测肺组织Defb2、MIP1、MIP2 mRNA的表达,ELISA法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)、纵膈淋巴结细胞培养上清中MIP1、MIP2、IFN-γ、IL-4的浓度,ELISA法检测血清总IgE以及OVA特异性IgE、IgG1、IgG2a水平。结果 Ms干预可以显著增高哮喘小鼠Defb-2 mRNA的表达(31.21±1.56对0.78±0.11,P<0.01);Ms干预可使哮喘小鼠表达增高的MIP1 mRNA降低(9.80±1.56对2.44±0.96,P<0.05),但对MIP2 mRNA的影响不明显(P>0.05);Ms干预可使BALF和淋巴结培养上清中MIP1、MIP2降低,使BALF和淋巴结培养上清中IL-4降低(97.43±7.83对153.80±5.20,150.75±54.58对625.81±55.98,P均<0.01),使BALF中IFN-γ升高(78.92±11.41对44.88±3.26,P<0.01);Ms干预可以显著降低哮喘小鼠血清总IgE、OVA-IgE、OVA-IgG1,升高OVA-IgG2a,降低哮喘小鼠OVA特异性IgG1/IgG2a比值(1.09±0.03对1.42±0.04,P<0.01)。结论 Ms黏膜免疫可以通过促进Defb-2表达增强哮喘小鼠抗感染能力,通过降低巨噬细胞炎症蛋白表达、调节Th1/Th2平衡、抑制过敏原特异性IgE表达等途径干预哮喘,耻垢分枝杆菌有望继卡介苗之后成为哮喘预防的另一候选疫苗。

GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌的构建及其在小鼠体内的表达

目的构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌,并经鼻黏膜免疫观察其在小鼠体内的表达。方法将人GLS和小鼠IL-12基因及分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到穿梭质粒pZM03,以pZM03电转化耻垢分枝杆菌,再将该重组耻垢分枝杆菌滴鼻免疫Balb/c小鼠3次,第1次免疫后4周,处死小鼠,用免疫组化检测肺、脾组织中GLS表达,用ELISA检测血清IL-12和肺泡灌洗液特异性SIgA的水平。结果得到可表达GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌;在Balb/c小鼠肺、脾组织中均检测到重组耻垢分枝杆菌的分布,以及GLS的表达,并有血清IL-12水平升高和黏膜特异性SIgA的产生。结论成功构建GLS和IL-12修饰的重组耻垢分枝杆菌,该重组菌经鼻黏膜免疫小鼠后,可引起呼吸道黏膜特异性抗菌免疫,以及GLS和IL-12的体内表达,为新型疫苗的研究奠定了基础。

耻垢分枝杆菌与卡介苗作为载体在鼠结核病治疗中的作用比较

目的比较耻垢分枝杆菌(MS)与卡介苗(BCG)作为载体在鼠结核病治疗中的作用。方法分别以不同剂量的MS和BCG免疫BALB/c小鼠,观察二者的致病作用。以结核分枝杆菌H37Rv感染BALB/c小鼠4周后,分别用生理盐水、MS、GLS/IL-12、重组MS、BCG及GLS/IL-12重组BCG治疗6次,于第6次治疗后7d处死小鼠,检测肺、脾荷菌量、血清IL-12和IFN-γ水平、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的水平及肺、脾组织中颗粒溶素表达,并观察小鼠肺组织病理改变。结果重组MS和重组BCG组器官荷菌量明显低于MS和BCG组;重组MS和重组BCG组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于MS和BCG组,MS和BCG组明显高于生理盐水组;重组MS和重组BCG组脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的水平明显高于其他组;MS与BCG组比较,重组MS与重组BCG比较,荷菌量、病理变化、肺、脾中的IL-12和IFN-γ水平差异均无显著意义;淋巴细胞中的IFN-γ和TNF-α水平,MS与BCG组差异有显著意义,而重组MS与重组BCG组差异无显著意义;重组MS和重组BCG组在肺、脾中均有颗粒溶素表达;MS所致病变比相同剂量BCG轻。结论MS与BCG一样,可将要表达的基因靶向递送到相应的组织,并诱导特异性细胞免疫,同时其在体内的副作用低于BCG,因此可作为良好的有机载体。

表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV-ESAT6,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc2155中。以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组(P<0.05)。结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础。

弓形虫重组耻垢分枝杆菌M.S-P30-ROP2载体活疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定弓形虫P30-ROP2复合基因重组耻垢分枝杆菌M.S载体活疫苗。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质粒pSTM3,构建重组质粒pSTM3-P30-ROP2,电穿孔法导入耻垢分枝杆菌中,潮霉素筛选、PCR法鉴定阳性转化子,温度诱导表达鉴定。结果获得pSTM3-P30-ROP2重组穿梭表达载体,SDS-PAGE结果显示P30-ROP2复合基因表达蛋白产物分子量约为66kDa。结论成功构建弓形虫复合抗原基因P30-ROP2重组耻垢分枝杆菌疫苗,为弓形虫病的防治提供了一种新方法。

乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc^2155细胞蛋白双向电泳图谱的差异分析

[目的]利用蛋白质组学方法,识别乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞后差异表达的蛋白质,为进一步探讨乙胺丁醇抑制分枝杆菌生长的作用机制及寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础。[方法]采用载体两性电解质pH梯度双向凝胶电泳技术分离乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞的总蛋白质,用PDQuest7.3.1图像分析软件比较分析,以识别差异表达的蛋白质。[结果]空白对照组有268个斑点,Ethambutol(EMB)处理组有蛋白斑点195个,在相对分子质量和pI值分布的任一区域,EMB处理组蛋白斑点数均少于空白对照组,其中在EMB处理组中特异表达的蛋白质斑点有23个。[结论]乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞的蛋白质组具有差异,这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究乙胺丁醇抑制分枝杆菌生长的作用机制并为寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础。

靶向递送人颗粒溶素与小鼠单链IL-12真核共表达质粒耻垢分枝杆菌的构建及鉴定

目的:构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠单链IL-12基因的真核共表达载体pZM03,并构建可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌菌苗.方法:将人GLS,小鼠单链IL-12基因和分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到穿梭质粒pZM03.以pZM03电转化耻垢分枝杆菌mc2-155,通过PCR方法检测重组菌中携带的真核共表达质粒;通过与小鼠巨噬细胞株RAW264.7共孵育检测重组菌的靶向性.结果:成功得到了可靶向递送GLS/IL-12真核共表达质粒pZM03进入巨噬细胞的新型重组菌.结论:利用耻垢分枝杆菌作为减毒生物体载体向巨噬细胞中靶向递送真核表达质粒是可能的.

耻垢分枝杆菌疫苗对小鼠巨噬细胞产生一氧化氮的影响

目的探讨耻垢分枝杆菌疫苗对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮的影响。方法将Balb/c小鼠随机分成生理盐水对照组和耻垢分枝杆菌疫苗低、中、高剂量组,分别注射生理盐水和不同剂量的耻垢分枝杆菌疫苗。取小鼠腹腔巨噬细胞体外培养,化学显色法测定培养上清中一氧化氮的含量。结果生理盐水对照组和耻垢分枝杆菌疫苗低、中、高剂量组产生的一氧化氮分别为(3.50±3.11)、(16.63±6.47)、(13.97±6.20)和(7.55±2.26)ng/ml,不同剂量疫苗免疫小鼠产生的一氧化氮水平均显著高于对照组(P<0.01)。结论耻垢分枝杆菌疫苗可促进小鼠巨噬细胞产生一氧化氮。

结核分枝杆菌肝素结合血凝素与人IL12融合基因重组耻垢分枝杆菌的构建及鉴定

目的构建表达肝素结合血凝素与人IL12融合基因的重组耻垢分枝杆菌并对其进行鉴定。方法通过RT-PCR从人淋巴细胞获得hIL12基因模板,采用PCR技术克隆hIL12的P40和P35两个亚基及结核分枝杆菌的HBHA基因,通过酶切鉴定及DNA测序证实连接的基因片段均正确后,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pSMT3-HBHA-hIL12,并用电穿孔法将重组质粒转到耻垢分枝杆菌中。分别用HBHA单克隆抗体和hIL12多克隆抗体检测HBHA和hIL12蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达,并测定重组耻垢分枝杆菌生长状态的改变。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,通过HBHA单抗和hIL12多抗进行免疫荧光法检测证实HBHA和hIL12均有表达,并且重组的耻垢分枝杆菌的生长速度比正常组有较大的提高。结论成功构建了表达结核分枝杆菌HBHA基因和人IL12的重组耻垢分枝杆菌,为构建一种结核病的候选疫苗提供了实验基础。

牛体内耻垢分枝杆菌噬菌体的分离与保存

鉴于体外分离噬菌体治疗价值的局限性,本研究从12份副结核血清学检测阳性的牛唾液和鼻黏液中成功分离纯化到不同牛体来源的4株耻垢分枝杆菌烈性噬菌体。电镜观察发现它们均属有尾病毒目,肌尾病毒科。为进一步研究和应用这些噬菌体,以其中一株为受试株,比较了16种保存方法,发现其中8种方法保存效果较好。

表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗作用

评价表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌用于结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗效果。结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠4周后,用表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫治疗,检测免疫小鼠肺部荷菌量和组织病理变化。重组耻垢分枝杆菌可有效控制感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量,减轻病理损伤。但在降低肺部荷菌量方面不如化疗药物。表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌可有效控制结核分枝杆菌在小鼠体内的增殖,可能成为联合化疗药物控制结核病的有效候选疫苗。