乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc^2155细胞蛋白双向电泳图谱的差异分析

[目的]利用蛋白质组学方法,识别乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞后差异表达的蛋白质,为进一步探讨乙胺丁醇抑制分枝杆菌生长的作用机制及寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础。[方法]采用载体两性电解质pH梯度双向凝胶电泳技术分离乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞的总蛋白质,用PDQuest7.3.1图像分析软件比较分析,以识别差异表达的蛋白质。[结果]空白对照组有268个斑点,Ethambutol(EMB)处理组有蛋白斑点195个,在相对分子质量和pI值分布的任一区域,EMB处理组蛋白斑点数均少于空白对照组,其中在EMB处理组中特异表达的蛋白质斑点有23个。[结论]乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞的蛋白质组具有差异,这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究乙胺丁醇抑制分枝杆菌生长的作用机制并为寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础。

异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc^2 155细胞蛋白双向电泳图谱的差异分析

目的利用蛋白质组学方法,识别异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2 155细胞(SM细胞)后差异表达的蛋白质,为进一步深入探讨异烟肼抑制分枝杆菌生长的作用机制及寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础。方法观察不同浓度的异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌生长曲线,确定药物处理SM细胞的最佳时间和浓度,并提取在最佳处理时间和浓度条件下的SM细胞总蛋白,采用载体两性电解质pH梯度双向凝胶电泳技术分离异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2 155细胞的总蛋白质,用PDuest7.3.1图像分析软件比较分析,以识别差异表达的蛋白质。结果在空白对照组检出159个蛋白斑点,在异烟肼处理组检出221个蛋白斑点,在相对分子质量30 000~90 000和pH值4.5~6.0范围内,异烟肼处理组蛋白斑点数均多于空白对照组。结论异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞的蛋白质组具有差异,提示异烟肼处理后促进了某些特定基因的表达。

不同抗生素对耻垢分枝杆菌细胞蛋白质差异表达

目的利用蛋白质组学方法,识别乙胺丁醇(EMB)、异烟肼(I NH)、利福平(RIF)处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞差异表达的蛋白质,探讨3种抗生素抑制分枝杆菌生长的作用机制及寻找新的抗结核药物作用靶标。方法采用载体两性电解质pH梯度双向凝胶电泳技术分离乙胺丁醇、异烟肼、利福平处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞的总蛋白质,用PDQuest 7.3.1图像分析软件比较分析,以识别比较差异表达的蛋白质。结果不同浓度的乙胺丁醇、异烟肼和利福平对耻垢分枝杆菌细胞的增殖均有不同程度的抑制作用。处理3 h时,耻垢分枝杆菌mc2155细胞增殖首次受到明显抑制;3种抗生素最佳处理浓度分别为:乙胺丁醇24.0μg/ml,异烟肼0.08μg/ml,利福平0.8μg/ml。比较蛋白质组分析显示,对照组有155个蛋白斑点,乙胺丁醇处理组有蛋白斑点147个,异烟肼处理组有蛋白斑点235个,利福平处理组有蛋白斑点161个。对照组、乙胺丁醇处理组,异烟肼处理组和利福平处理组的蛋白斑点的分布明显不同。结论3种抗生素处理前后,耻垢分枝杆菌mc2155细胞蛋白质组的差异分析有助于进一步研究抗生素的作用机制,并为寻找新的抗结核药物作用靶标提供基础依据。

构建CRISPR-Cas9介导的耻垢分枝杆菌基因组高效删除系统

【背景】耻垢分枝杆菌具有生长迅速和非致病性的特点,可作为结核分枝杆菌致病机理研究替代菌株和类固醇激素生产的工程菌,但目前耻垢分枝杆菌中缺乏高效率的基因组敲除方法。【目的】基于CRISPR-Cas9介导的定点、高效的DNA切割能力,构建耻垢分枝杆菌染色体DNA片段无痕敲除系统。【方法】构建了包含四环素诱导型启动子驱动的密码子优化的cas9基础载体pCas9101,在双侧同源臂长度约为1 kb条件下选用合适的gRNA表达模块,分别测试了对耻垢分枝杆菌mc2155染色体上的3β-羟基类固醇脱氢酶基因(MSMEG_5228,1 071 bp)和胆固醇降解基因簇(MSMEG_5990-MSMEG_6043,约48kb)敲除效率,使用相同大小的同源臂以经典p2NIL-pGOAL方法进行对照,并计算效率。【结果】使用CRISPR-Cas9方法对耻垢分枝杆菌mc2155的3β-羟基类固醇脱氢酶基因敲除效率为22%,胆固醇降解基因簇敲除效率也达到18%,两者连续敲除效率为4%。但对照p2NIL-pGOAL方法未能获得目标DNA片段敲除的菌株。【结论】本文建立的基于CRISPR-Cas9的耻垢分枝杆菌基因组无痕敲除系统显示出较高的敲除效率,该方法可为耻垢分枝杆菌后续研究提供快速高效的基因组操作方法。