大肠杆菌耐利福定突变基因的克隆及限制性酶切谱分析

本文四株耐利福定(Rifandine,RFD)大肠杆菌(MIC为500ug/ml)均采用RFD浓度梯度平皿从相应敏感菌株筛选获得,连续传种二代其耐药性保持稳定;对四株耐RFD大肠杆菌,采用酚一氯仿法。

限制性内切酶分析法在柯萨奇B组病毒检测及分型中的应用

目的 探讨限制性内切酶分析法在柯萨奇B组病毒B1～B6型检测及分型中的应用。方法 利用GCG软件对柯萨奇B1～B6型病毒cDNA全序列进行了限制性内切酶酶切位点的分析。结果 共 114种限制性内切酶在柯萨奇B1～B6型病毒cDNA中分布有不同数量的酶切位点。经过比较和分析 ,得到了它们的一个共同cDNA片段 ,在这个cDNA片段中 ,B1～B6型病毒各自具有特异性的核苷酸序列 (特异的限制性内切酶位点 ) ,对柯萨奇B组病毒 6个已知型别标准毒株进行了成功的分型和检测。结论 本方法有效地解决了在柯萨奇B组病毒检定以往方法中所存在的非特异性问题 ,可以对柯萨奇B组病毒进行准确的检定和型别鉴定。

传染性非典型肺炎限制性内切酶检测方法的研究

目的建立一种对传染性非典型肺炎,又称严重急性呼吸综合征(SARS)准确诊断的新方法。方法利用GCG软件将已公布的SARS病毒变异品系与人类基因组、人类易感病原体进行比对分析。结果筛选出了用于检测的ScDNA核苷酸片段,并在该片段中确定特异性的酶切位点,使检测方法的准确性得以保证。结论与传统检测方法比较,限制性内切酶分析法完全克服了检测中非特异性结果的产生,使检测结果准确可靠。

贵州省江口县土家族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变分析

目的:了解贵州省江口县土家族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷症的基因频率、基因突变类型特点及分布特征,从分子水平揭示G6PD基因多态性。方法:采集世居当地土家族男性血液样本227例,用四氮唑蓝(NBT)纸片定性法及G6PD/6PGD比值法做G6PD缺陷症筛查。确诊者用错配引物介导的聚合酶链反应/限制性内切酶酶切分析法(PCR-RE)进行中国人常见9种G6PD基因突变型分析,突变特异性扩增系统法(ARMS)验证其中3种突变。结果:227名土家族男性中检出17例G6PD缺陷者,总检出率7.49%,G6PD缺陷症基因频率0.0749。基因分析检出cDNA 1388(G→A)12例,在G6PD缺陷者中的基因频率为0.706,未知突变5例,基因频率为0.294。结论:G6PD缺陷症在贵州土家族人群有着较高的基因频率,其主要突变类型为G6PD基因cDNA 1388(G→A)。

柯萨奇B组病毒3种检测方法的比较

目的探讨限制性内切酶分析法检测柯萨奇B组病毒的特异性和重现性。方法收集500例疑似病毒性心肌炎的患者血清,分别采用限制性内切酶分析法、ELISA法、RT-PCR法3种检测方法进行检测,每种方法在相同条件下连续重复3次,然后将其结果进行比较。结果ELISA法的3次检测的结果差别较大,阳性率分别为55.4%、58.4%、60.6%;RT-PCR法的3次检测的结果差别相对较小,阳性率分别为51.1%、51.6%、52.8%;限制性内切酶分析法的3次检测结果完全一致。结论限制性内切酶分析法是一种特异性强、重现性好,明显优于ELISA法和RT-PCR法的新的病毒检测方法。

人乳头瘤病毒11型DNA中CpG基序甲基化状态分析及生物活性的研究

目的 对人乳头瘤病毒 11型全核苷酸序列的CpG基序 (CpGmotifs)进行分析 ,为阐明尖锐湿疣的发病机制和提高DNA疫苗的效能奠定理论基础。方法 对从pBR32 2 HPV11重组质粒上酶切下来的HPV11全长DNA进行计算机分析 ,包括分类、计数和定位 ;并用限制性内切酶PCR法分析HPV11DNA中CpG基序的甲基化状态 ,即分别用甲基化敏感的限制性内切酶AccⅡ、HaeⅡ和HpaⅡ对HPV11DNA进行酶切消化 ,再以HpaⅡ切割位点侧翼序列为引物 ,以HpaⅡ酶切产物为模板 ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增HPV11DNA片断 ,并用HPV11DNA刺激表达有pCIneo TLR9的HEK2 93细胞 ,ELISA法检测TNF al pha、IFN alpha和IL 12的分泌。结果 CpG的“C”的侧翼为两个嘌呤 ,“G”的侧翼为两个嘧啶 ,在HPV11中共 14个。HPV11全基因组被AccⅡ切成 2个片断、被HaeⅡ切成 3个片断、被HpaⅡ切成 5个片断 ,而且以HpaⅡ酶切产物为模板进行PCR扩增 ,未能得到相应的片断。HPV 11DNA刺激有人TLR9表达的HEK2 93细胞后能检测到TNF alpha、IFN alpha和IL 12的分泌。结论 乳头瘤病毒 11型DNA中含有GACGTT等非甲基化的CpG基序 。

PCR-RFLP法检测生殖道沙眼衣原体感染

目的 建立检测沙眼衣原体的聚合酶链反应 -限制性内切酶切片段长度多态性分析 (PCR -RFLP)方法。方法 在利用PCR扩增沙眼衣原体的基础上 ,引入RFLP方法 ,并与美国ABI公司的金标免疫层析法试剂盒和镜检包涵体法比较。结果 共检测 40例临床确诊病人 ,镜检包涵体法有 15例 (37.5 % )阳性 ,金标免疫层析法有 2 3例 (5 7.5 % )阳性 ,而PCR-RFLP法有 2 9例 (70 .3 % )阳性 ,各组间有显著性差异 (P <0 .0 5 )。结论 我们认为PCR -RFLP法优于镜检包涵体法。

三种基因检测分型方法在耐碳青霉烯抗生素肺炎克雷伯菌基因分型中的应用对比观察

目的比较限制性内切酶联合脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)和肠杆菌基因间重复序列PCR(ERIC-PCR)在耐碳青霉烯抗生素肺炎克雷伯菌基因分型中的应用情况。方法 20株耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌,分别采用PFGE、MLVA和ERIC-PCR法,对肺炎克雷伯菌基因进行扩增并分型,并用Bio Numerics软件测算各方法 Simpson差异指数(D值,D值越趋于1表示该方法分辨力越好)。结果20株菌株共分为18个PFGE型,其中2个带型包含2株菌,其余16个带型分别只包含1株菌,分别有两组两株菌具有相同的PFGE型别;17个MLVA型,其中3个型别分别包含2株菌,其余16个型别只包含1株菌,以差异位点≤2个位点作为构建MLVA群的标准,20株菌中构建出4个MLVA克隆群;14个ERIC型,其中中优势型、次优势型分别为5、3株,其余12个型别分别只包含1株菌。PFGE、MLVA和ERIC-PCR法对耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌的D值分别为0.989 5、0.984 2、0.931 6。结论 PFGE、MLVA和ERIC-PCR对耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌的分型效果均较好。

新疆哈萨克族食管癌患者ALDH1L1基因甲基化及其与预后的关系

目的:探讨新疆哈萨克族食管癌患者ALDH1L1基因甲基化状态及其与食管癌发生及预后之间的关系。方法:采用联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析(COBRA)法检测28例哈萨克族食管癌及癌旁组织标本中ALDH1L1基因启动子区甲基化状况,建立Cox回归模型分析临床病理指标、ALDH1L1基因甲基化水平等因素与预后的关系。结果:28例哈族食管癌患者癌组织和癌旁正常组织的ALDH1L1基因启动子甲基化率分别为71.43%和39.28%,差异有统计学意义(P<0.05)。预后因素分析表明肿瘤浸润程度、TNM分期、淋巴结转移、癌组织ALDH1L1基因甲基化水平是影响哈萨克族食管癌预后的独立危险因素。癌组织ALDH1L1基因无甲基化患者术后生存时间长于完全甲基化患者(P<0.05)。结论:癌组织ALDH1L1基因启动子区甲基化状态与新疆哈萨克族食管癌的发生及预后有关。

三类整合酶基因(intⅠ)的简并引物PCR方法建立及应用

目的 建立一种筛选第一、二和三类整合酶基因 (intⅠ )的简并引物PCR方法 ,并对临床菌株进行整合子筛选和分类。方法 用梯度PCR方法确定PCR反应的最适退火温度 ,并对 1 6株临床标本进行PCR扩增 ,通过对阳性PCR扩增产物的限制性内切酶分析进行整合子分类。结果 根据梯度PCR结果确定最适退火温度为 4 6℃。应用简并引物PCR法检测 1 6株临床分离株 ,其中 8株阳性 ,经酶切分类后确定其中 4株只含有第一类整合酶基因 ,有 3株含有第二类整合酶基因 ,1株同时含有第一类和第二类整合酶基因。结论 建立了一种同时筛选第一、二和三类整合子的方法 ,实际检测显示其可行性 ,为全面细致研究整合子介导的细菌耐药提供了一种快速、简便的方法。

B-纤维蛋白原-455G/A基因多态性对缺血性心脏病患者血浆纤维蛋白原水平的影响

目的 探讨β-纤维蛋白原 - 4 55G/ A(β- Fg- 4 55G/ A)基因多态性与环境因素对血浆 Fg表达的调节机制及与缺血性心脏病 (IHD)发病的关系。方法 应用 PCR及限制性内切酶分析的方法 ,分析 75例 IHD及 1 56例对照者 β- Fg- 4 55G/ A基因多态现象 ,比浊法测定血浆 Fg水平。结果 病例组血浆 Fg水平明显高于对照组 (P<0 .0 1 )。无论男、女患者与对照 ,A基因携带者血浆 Fg水平比同组 GG基因型者明显升高 (P<0 .0 5)。对照组中的 A基因携带者与病例组中的 GG基因型者 ,随增龄血浆 Fg水平有明显升高 (P<0 .0 5)。 IHD患者男性 ,按吸烟及基因型情况分组 ,相同基因型时 ,吸烟组血浆 Fg水平高于不吸烟与戒烟组 (P<0 .0 5)。病例组 A基因频率明显高于对照组 (P<0 .0 0 5)。结论 β- Fg- 4 55 G/ A等位基因与血浆 Fg水平相关 ,A基因携带者 IHD发病率更高。提示 β- Fg- 4 55G/ A可作为

40例α地中海贫血的实验诊断及基因型

在2992例贫血原因待查者中,采用血红蛋白生化分析,诊断α地中海贫血40例,其中,HbH 14例,HbH-Bart′s 9例,α地中海贫血1 12例,α地中海贫血2 5例。继采用限制性内切酶图谱分析结合聚合酶链反应技术,检出基因型:--SEA/-α3.723例,--SEA/αα12例,αα/-α3.75例。

基因突变的检测

1985年以前对基因中显著的缺失、插入、重排,可以用Southern杂交法来鉴定。一些小的变异,包括单碱基改变,只有当它们位于限制性内切酶的切点上时,方可被检出(如RFLP,限制性片段长度多态性)。如果这些小的变异不是位于限制性内切酶的切点上,那么只有对整个的基因进行顺序测定,当然,这是费时费力的。

感染PRRS病毒仔猪的神经毒性

最近K.O.Rossow等观察并报导了免疫仔猪受PRRSV活疫苗感染后的神经毒性。这些新生仔猪经病毒分离法、荧光抗体检验、血清学、免疫组织化学和原位杂交法诊断其受PRRS病毒感染并使用了弱毒活疫苗。用限制性酶切分析法和对PRRS病毒的ORF5％、ORF6

同型半胱氨酸及代谢酶基因多态性与脑卒中的相关性研究

目的进一步确定亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T、胱硫醚β合成酶(CBS)基因844ins68、T27796C和甲硫氨酸合成酶(MS)基因A2756G这4种基因突变在脑卒中发病中的意义。方法选择年龄及性别基本匹配的脑梗死组78例、脑出血组26例、神经系统其他疾病组29例和健康老年组50例,采用酶联免疫分析法测定受检者血浆同型半胱氨酸(Hcy)浓度,并运用多聚酶链反应限制性内切酶片段长度多态性技术,检测基因表型。结果脑梗死组和脑出血组血Hcy浓度明显高于神经系统其他疾病组和健康老年组。CBS844ins68及MSA2756G突变频率较国外报道明显低。此外,C677T纯合突变型的Hcy水平均高于野生型和杂合突变型,CBST27796C基因杂合子突变则可能使Hcy水平降低;而4种基因各组之间基因型频率差异无统计学意义。结论Hcy水平与脑卒中的发生有一定联系。CBS844ins68和MSA2756G突变可能存在种族或地域差异,MTHFRC677T纯合子突变可能是导致血浆总Hcy(tHcy)水平升高的遗传决定簇,而CBST27796C基因杂合子突变可能引起tHcy水平的降低;4种基因突变符合遗传平衡定律。

卡他莫拉菌耐药性与β内酰胺酶分型

目的对卡他莫拉菌BROβ内酰胺酶进行分型分析,并对其与抗菌药物耐药的关系进行探讨。方法采用BSAC(britishsocietyforantimicrobialchemotherapy,BSAC)琼脂稀释法对本院呼吸道感染患儿鼻咽部分离的80株卡他莫拉菌株进行8种药敏试验,用Nitrocefin纸片检测β内酰胺酶,采用限制性内切酶分析方法进行bro基因分型,同时将bro1基因阳性和bro2基因阳性菌株对β内酰胺类抗菌药物的耐药性进行比较。结果(1)80株卡他莫拉菌β内酰胺酶阳性率为95.0%。对氨苄西林MIC90为32μg/ml,对头孢呋辛、头孢克洛和头孢噻肟的MIC90分别为4、8、1μg/ml,对四环素的MIC90为16μg/ml;环丙沙星为最敏感的抗菌药。(2)80株卡他莫拉菌bro基因分型结果:6株(7.5%)bro阴性,55株(68.8%)bro1阳性,19株(23.8%)bro2阳性。其中有2株bro基因阴性经Nitrocefin纸片法检测,β内酰胺酶结果为阳性,其他菌株基因检测与产酶结果一致。(3)bro1阳性菌株对氨苄西林、头孢克洛的MIC90值与bro2阳性菌株相比,有不同程度的升高。结论我国儿童携带的卡他莫拉菌产酶率高,对氨苄西林高度耐药。目前应加强该菌对头孢类和四环素的耐药监测。限制性内切酶分析方法在检测bro基因、筛选卡他莫拉菌对β内酰胺类抗生素的耐药及分子流行病学调查方面有一定的应用价值。

马拉色菌临床株分类鉴定的研究

目的用PCR-RFLP方法对马拉色菌临床株快速分类,并结合生化鉴定分析结果的可靠性。方法先用吐温试验和过氧化氢酶试验对74株分离自花斑癣的马拉色菌临床株和7株标准菌株进行分种,再用特异性引物扩增马拉色菌的28SrDNA,对扩增产物分别用Eco88Ⅰ、Bsp143Ⅱ和BshNⅠ进行RFLP分析。结果3种限制性内切酶成功地将限制、钝形和厚皮马拉色菌鉴定出来,并发现限制马拉色菌在基因同源性上与其他6种马拉色菌存在较大差异。此外通过RFLP法还纠正了生化分型的错误。结论PCR-RFLP法是一种有希望能够快速、准确对马拉色菌属进行种间分类的分子生物学技术。