联合转染tPA基因和PCNA反义寡核苷酸抑制兔自体移植动脉再狭窄研究

目的研究血管局部联合转染组织型纤溶酶原激活物(tPA)基因和增殖细胞核抗原反义寡核苷酸(PCNA-ASODN)对自体移植动脉血管再狭窄的防治作用。方法120只新西兰雄性白兔,按数字表法随机均分为4组(对照组、PCNA-ASODN组、tPA组、tPA+PCNA-ASODN组)。将同一只兔的左、右髂外动脉(各1.0cm长)对换移植,移植血管及吻合口缝线分别用pBudCE4.1/tPA和PCNA-ASODN液浸泡。于术后3、7、14、28及56d取移植血管制片,显微镜下观察内膜增生情况,计算机图像分析测量其内膜面积和移植血管狭窄率,扫描电镜观察移植血管壁血栓形成情况,并分别用RT-PCR和免疫组织化学染色法检测tPA基因的mRNA表达率与PCNA阳性细胞百分率。结果术后3、7、14和28d时,tPA组与tPA+PCNA-ASODN组的tPA基因mRNA表达率明显高于另2组(P<0.01),PCNA-ASODN组、tPA组和tPA+PCNA-ASODN组PCNA阳性细胞百分率均明显低于对照组(P<0.05,P<0.01)。tPA+PCNA-ASODN组和PCNA-ASODN组、tPA组各时相血管壁内膜增生比对照组明显减轻,内膜面积和管腔狭窄程度显著低于对照组(P<0.05,P<0.01),且tPA+PCNA-ASODN组又明显低于另2组(P<0.05)。扫描电镜观察显示,tPA组和tPA+PCNA-ASODN组血管壁只见少量血小板附着,未见血栓形成,而对照组血管壁可见大量血小板附着,且有血栓形成。结论血管局部联合转染tPA基因和PCNA-ASODN能有效抑制VSMC增殖和血栓形成,阻止内膜增生,防止移植血管狭窄。

Livin和Survivin基因短发夹RNA真核表达载体的构建及其联合转染对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的设计并构建能够有效干扰Livin和Survivin基因的表达,且能在胞内稳定转录的表达载体;研究Livin shRNA和Survivin shRNA的联合转染对肝癌细胞增殖活性及凋亡的影响。方法根据设计siRNA的原理,分别从Livin、Survivin基因序列中选取两段siRNA靶序列模板,以其为基础进行shRNA真核表达载体Pgenesil-1-Livin和Pgenesil-1-Survivin的构建。将传代培养的肝癌Hep G2细胞株分为五组:设阴性对照组(不转染)、空白质粒组(单独转染Pgenesil-1-NC)、Survivin组(单独转染Pgenesil-1-Survivin)、Livin组(单独转染Pgenesil-1-Livin)和共转染组(联合转染Pgenesil-1-Livin和Pgenesil-1-Survivin),对各组细胞进行单独或联合转染。为检测转染2 d后Livin和Survivin蛋白表达的情况、转染后三个不同时间点(48 h、60 h、72 h)的细胞增殖活性变化及转染后48 h的细胞凋亡率,分别采用了蛋白质印迹法、MTT法及TUNEL法。结果两种表达载体的测序结果与预期相同。与阴性对照组及空白质粒组相比,转染后2 d,Livin组、Survivin组和共转染组的蛋白表达均明显下降(P<0.05),而与Livin组和Survivin组相比,共转染组蛋白表达的下降更为显著(P<0.05);各组细胞在3个检测时间均表现出增殖活性的下降,且与Livin组和Survivin组相比,共转染组在三个检测时间的细胞生长抑制率(IR)值分别为28.541±0.842、21.644±0.129、15.532±1.12,明显高于前者(P<0.05);转染后48 h,共转染组凋亡率为53.956%±4.332%,明显大于Livin组和Survivin组(P<0.05)。结论成功设计并构建体内可稳定转录且能有效干扰目的基因表达的质粒载体。对肝癌细胞进行Livin shRNA和Survivin shRNA的联合转染,可更大程度下调相应基因的表达,降低Livin蛋白和Survivin蛋白的胞内含量,可更为有效地阻碍癌细胞的异常增殖,促进癌细胞的程序性凋亡。

Bcl-2与HER-2反义寡核苷酸联合转染对人舌鳞癌Tca8113细胞的干预作用

目的探讨Bcl-2与HER-2基因反义寡核苷酸(ASODN)联合转染对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖的干预作用及其分子机制。方法实验分成正常对照组、Bcl-2正义干预组、HER-2正义干预组、Bcl-2反义干预组、HER-2 反义干预组、Bcl-2与HER-2基因反义寡核苷酸联合干预组,共6组。脂质体转染后不同时间分别进行电镜观察、 RT-PCR检测,以观察不同条件处理后各组细胞的凋亡、Bcl-2与HER-2基因表达有无差别。结果 Bcl-2与HER-2 基因反义寡核苷酸联合干预组,转染后出现凋亡小体和各期凋亡细胞;Bcl-2基因表达下降36％,HER-2基因表达下降51％。联合转染作用优于单反义基因转染作用。结论 Bcl-2与HER-2基因反义寡核苷酸联合转染能够促进肿瘤细胞凋亡并下调Bcl-2与HER-2基因的表达。

联合转染p53、AS基因对K562细胞增殖的抑制作用

本研究观察联合转染p53、血管生成抑素(angiostatin,AS)基因对人K562细胞的抑制作用,并初步探讨其机制。用脂质体转染法将pVITRO2-hp53-hAS转染K562细胞17天后,以RT-PCR法检测转染后细胞目的基因的表达,通过MTT生长曲线、流式细胞术检测细胞周期来观察细胞生物学改变;用细胞免疫化学观察VEGF、Bcl-2、Bax蛋白表达差异。结果表明:转染成功后目的基因在细胞中获得稳定表达,目的基因转染组细胞上升幅度均比空载体转染组细胞低(p<0.05),且双基因组细胞上升幅度(最后1天的A290nm值0.264±0.011)比p53组(最后1天的A290nm值0.652±0.039)和AS组(最后1天的A290nm值0.604±0.017)低(p<0.05)。转染后,VEGF和Bcl-2蛋白表达减弱,Bax蛋白表达加强。结论:联合转染p53和AS基因对K562细胞增殖有较强的抑制作用,且比单独转染组作用强,两者协同作用的机制可能是共同影响bcl-2、bax表达的途径。

联合转染P^(21)基因和c-Fos反义核酸对自体移植静脉内膜增生的影响

目的 探讨联合转染P2 1基因和c -Fos反义核酸对自体移植静脉内膜增殖的影响。 方法 选择 2 0只新西兰家兔 ,随机等分为实验组和对照组 ,均行自体颈外静脉、颈总动脉移植手术 ,仅实验组移植静脉段行腺病毒介导的P2 1基因溶液浸泡、吻合口周围行c-Fos反义核酸凝胶涂布 ;术后 2周取出移植血管 ,分别行病理学、免疫组织化学检查。 结果 实验组移植血管内膜厚度、管腔狭窄度、内膜平滑肌细胞数以及增殖细胞核抗原 (PCNA)阳性表达细胞数均较对照组明显减少。 结论 联合转染P2 1基因反义c -Fos核酸可有效地抑制移植静脉内膜的增生 ,是一种比较有发展前途的防治移植静脉再狭窄的基因疗法。

联合转染p21基因及反义C-Fos核酸对自体移植静脉内膜增生的影响

①目的 探讨联合转染p2 1基因及反义C Fos核酸对自体移植静脉内膜增生的影响 ,探索一种理想的预防血管再狭窄的基因疗法。②方法 选用 2 0只新西兰家兔 ,实验组 10只 ,对照组 10只 ,均行自体颈静脉、颈总动脉移植手术 ,实验组行腺病毒介导的p2 1cDNA溶液浸泡和反义C Fos寡聚核酸凝胶涂布 ;对照组仅行空载腺病毒溶液浸泡和凝胶涂布。术后 2周取出移植血管 ,分别检测移植血管内膜厚度、内膜平滑肌细胞数 (VSMC)及内膜平滑肌细胞增殖细胞抗原 (PCNA)阳性表达情况。③结果 实验组移植血管内膜厚度、管腔狭窄度、VSMC数及PCNA阳性表达情况较对照组均有明显差异 (t=2 8.30～ 38.5 2 ,P <0 .0 1)。④结论 联合转染p2 1基因及反义C Fos核酸可有效地抑制移植静脉内膜的增生 ,是一种有效防治移植静脉再狭窄的基因疗法。

联合转染血管内皮生长因子165和组织纤溶酶原激活物基因抑制兔血管损伤后内膜增生的研究

目的观察血管局部联合转染血管内皮生长因子165(VEGF165)和组织纤溶酶原激活物(tPA)基因对损伤动脉内膜增生的影响并探讨可能机制。方法采用显微外科手术方法建立兔动脉损伤模型;用微注射装置将基因转染液注入损伤血管壁,按实验终点(术后2d、1周、2周、4周和8周)分为5个亚组(每个亚组8只兔);术后各实验终点取损伤段血管用于病理学检测、电镜观察、RTPCR和免疫组织化学检查。结果术后各时间点基因转染组血管壁的VEGF165基因的mRNA表达量和tPA阳性细胞数明显高于对照组(P<0.01)。与对照组比较,术后各时间点基因转染组血管内膜面积和狭窄率均显著减小(P<0.01),术后8周时基因转染组管腔狭窄率比对照组降低了59.0%。结论局部联合转染VEGF165和tPA基因可抑制血管新生内膜增生及血管再狭窄。

联合转染VEGF和PCNA-ASODN对血管成形术后再狭窄的影响

目的探讨联合转染血管内皮生长因子(VEGF)基因和增殖细胞核抗原反义寡核苷酸(PCNA-ASODN)对血管成形术后再狭窄的影响。方法 32只新西兰纯种大白兔随机平均分为对照组、转染VEGF组、转染PCNA-ASODN组、联合转染VEGF和PCNA-ASODN组(联合转染组)。构建兔的股髂动脉球囊损伤术后再狭窄模型,以医用生物蛋白胶作为缓释载体,将300μg PCNA-ASODN或VEGF均匀喷布于处理血管段外膜。取损伤处理血管段标本,光学显微镜观察损伤血管内膜、中层结构和局部血栓形成情况;电子显微镜观察新生内膜内皮细胞及内膜、中膜,计算内膜/中膜(I/M)面积比与厚度比;采用RT-PCR法检测VEGF与PCNA基因的表达,采用免疫组化从蛋白质水平检测VEGF与PCNA的表达。结果联合转染组与其他组相比,其血管内皮较完整、光滑,内膜轻度增生,平滑肌细胞排列规则,外膜无明显变化;I/M面积比与厚度比明显较低(P<0.05);RT-PCR检测VEGF表达水平明显升高(P<0.05);免疫组化检测血管组织中VEGF蛋白表达阳性率较高(P<0.05)。结论联合转染VEGF和PCNA-ASODN能更有效地抑制球囊损伤术后的血管内膜增生和再狭窄的发生。

c-erbB-2与c-raf-1反义寡核苷酸转染对卵巢癌SKOV_3细胞的作用

目的:探讨c-erbB-2与c-raf-1基因ASODN联合转染对人卵巢癌细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法:实验分为7组:对照组、c-erbB-2正义治疗组、c-raf-1正义治疗组、c-erbB-2反义治疗组、c-raf-1反义治疗组、全剂量联合治疗组和半剂量联合治疗组。脂质体转染后不同时间分别进行MTT试验、集落形成试验、荧光显微镜检测、蛋白质荧光强度测定与免疫组织化学检查,以观察不同条件处理后各组细胞的增殖、凋亡、蛋白质表达有无差别。结果:与对照组比较,全剂量联合治疗组和半剂量联合治疗组,转染72h的光密度值分别为0.151(P<0.005)和0.073(P<0.005),增殖抑制率分别达到了88.7%和94.5%,克隆形成率分别为19.4%(P<0.01)和12.8%(P<0.01),凋亡率分别为24.3%(P<0.05)和31.5%(P<0.01),同时明显地下调了c-erbB-2、c-raf-1、PCNA、c-jun、c-fos基因蛋白质的表达水平。结论:c-erbB-2与c-raf-1基因反义寡核苷酸联合转染对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用优于单反义基因,其对卵巢癌细胞增殖的抑制作用可能通过下调c-erbB-2、c-raf-1、PCNA、c-jun、c-fos基因蛋白的表达水平实现。

iNOS基因在胶质细胞中转录激活机制初探

目的:通过瞬时转染p38MAPK途径中上游激酶:组成激活型MAPK激酶3(MKK3b)和MAPK激酶6(MKK6b),进一步了解p38MAPK级联传导信号系统调节iNOS基因在胶质细胞中的转录激活机制。方法:MKK3b或MKK6b与接有荧光素酶(luciferase,Luc)的大鼠iNOS启动基因质粒(iNOS-Luc);cAMP反应元件(CRE-Luc)和核因子κB(NFκB-Luc)联合转染C6胶质细胞株。结果:MKK3b/MKK6b能引起iNOS-Luc的激活,并都能够被p38MAPK抑制剂SB203580所抑制。MKK可以诱导cAMP反应元件(CRE-Luc)介导的和核因子κB(NFκB-Luc)依赖的转录活性。显性抑制型(dominantnegative,dn)CRE结合蛋白(dnCREB)和CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)都是p38MAPK的靶向作用目标。结论:转染这两种转录因子产生相反的影响:dnCRE增强了iNOS-Luc的表达,而dnC/EBP则引起抑制作用,对CRE-Luc也具有相同的影响。

RNAi沉默c-erbB-2、c-raf-1表达对人舌鳞癌Tca8113细胞的干预作用

目的 :探讨应用RNA干扰技术沉默c-erbB - 2、c -raf- 1基因表达 ,研究其对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法 :实验分成 3组 :空白对照组、正常对照组、c -erbB - 2、c-raf- 1dsRNA联合干扰组。脂质体转染后不同时间分别进行MTT试验、电镜检测、RT -PCR ,以观察不同条件处理后各组细胞的增殖、凋亡、细胞周期、mRNA及蛋白质表达有无差别。结果 :c-erbB - 2、c -raf- 1dsRNA联合干扰组 ,转染 72h的OD值为 0 .0 73(P <0 .0 0 5 ) ,增殖抑制率达到了94 .5 % ,凋亡率为 76 .5 % (P <0 .0 1) ,明显地下调c-erbB - 2与c -raf- 1基因mRNA及其蛋白质的表达水平。结论 :在舌癌Tca8113细胞株增殖的抑制作用研究中 ,c-erbB - 2、c -raf- 1dsRNA联合干扰具有显著沉默c -erbB - 2、c -raf- 1基因表达。

生物起搏细胞调控方法的研究进展

自从电子起搏器进入临床以来,无数房室传导阻滞和病态窦房结综合征患者的生活质量得到了极大改善,但它仍存在感染、缺乏生理反应性和电池寿命有限等问题。生物起搏就此应运而生,生物起搏核心的问题是获得和正常窦房结细胞具有相同功能的起搏细胞,目前调控生物起搏细胞生成的方法多种多样,例如可通过单基因、多基因联合以及信号通路调控等方法来构建生物起搏细胞,现就当前生物起搏细胞的调控方法做一综述。