检测犬细小病毒和犬瘟热病毒联合PCR/RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立一种能同时检测犬细小病毒(CPV)和犬瘟热病毒(CDV)的快速鉴别PCR方法,试验根据GenBank中登录的CPV NS1基因和CDV F基因序列设计2对特异性引物,通过综合CPV单项PCR方法与CDV单项RT-PCR方法的扩增程序,最后确定出联合PCR/RT-PCR方法的最佳退火温度、延伸时间和循环次数等反应程序,并对扩增产物进行克隆鉴定,同时进行特异性试验、敏感性试验和临床病料的检测。结果表明:建立的联合PCR/RT-PCR方法可以在一个扩增体系内同时检测两种病毒,其最佳联合PCR/RT-PCR扩增退火温度为50.8℃;经特异性分析,联合PCR/RT-PCR方法对犬副流感病毒(CPIV)、狂犬病毒(RV)、犬腺病毒(CAV)的检测为阴性;经敏感性分析,联合PCR/RT-PCR方法在模板浓度稀释到1×10~0 TCID_(50)时仍能见到较清晰的特异性条带;应用联合PCR/RT-PCR方法对延吉市36份犬病料样本进行检测,CPV阳性率为25.00%,CDV阳性率为33.33%,CPV和CDV混合感染阳性率为8.33%。说明试验建立的CPV和CDV联合PCR/RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高,可用于犬细小病毒病和犬瘟热病毒病的临床诊断。

STR-PCR联合RT-PCR技术在慢性髓细胞白血病患者异基因造血干细胞移植后微小残留病变检测中的应用

为了探究STR PCR联合bcr/abl融合基因转录本RT PCR定性检测技术对慢性髓细胞白血病 (CML)异基因造血干细胞移植 (allo HSCT)后复发的预测价值 ,对接受allo HSCT的 2 4例CML患者进行微小残留病变(MRD)的动态检测 ,对供体细胞嵌合率 (DC)采用复合扩增荧光标记STR PCR结合毛细管电泳方法进行定量检测 ,对bcr/abl融合基因转录本采用巢式RT PCR方法检测。结果显示 :移植后长期处于完全供体细胞嵌合状态(FDC)即DC≥ 95 %的患者bcr/abl均转为阴性 ,MRD消失 ;稳定混合嵌合状态 (MC)即 90 %≤DC <95 % ,并且bcr/abl阴性的患者 ,也可达到分子水平的缓解并长期生存 ;但是bcr/abl的阳性结果并不总是与复发相关 ,只有当DC进行性下降 (DC <90 % ) ,而同时bcr/abl阳性时 ,才有复发或植入失败的可能 ,对该类患者应尽早实施临床干预性治疗。本研究中有 5例患者出现DC下降和MRD阳性 ,其中 3例为分子水平复发 ,1例为细胞遗传学水平复发 ,1例为植入失败。结论 :STR PCR在敏感范围内 ,其结果与RT PCR的结果符合率高 ,两种技术的结合是一种检测MRD高度敏感的手段 ,可检出allo HSCT后发生分子生物学或细胞遗传学复发的高危患者。

H5和H9亚型禽流感病毒联合RT-PCR检测方法的建立

目的建立H5和H9亚型禽流感病毒(AIV)联合RT-PCR检测方法。方法针对H5和H9亚型AIV血凝素(HA)基因,在其裂解位点两侧设计引物。在确定单项RT-PCR检测方法反应条件基础上,建立、优化联合RT-PCR反应体系和反应条件,并通过相关病毒检测试验,验证其敏感性和特异性。结果所建立的H5和H9亚型联合RT-PCR检测方法具有特异、敏感、简便、快捷等特点。结论该方法可用于AIV的检测及致病性分析。

O型口蹄疫病毒不同基因型联合RT-PCR检测方法的建立

在比较国内外口蹄疫病毒 (FMDV)流行毒株序列的基础上 ,设计了检测 FMDV的 PCR引物及 O型 FMDV不同基因型即中国型 (Cathay)与乏亚株 (Pan Asia)的二联 PCR引物。在确定单项 RT- PCR反应条件的基础上 ,建立、优化了二联 RT- PCR反应体系和条件 ,并进行了相关病毒检测试验。结果表明 ,建立的检测 O型 FMDV不同基因型中国型与泛亚株的二联 RT- PCR,有效、特异且敏感 ,为 FMD的诊断。

犬瘟热和犬冠状病毒联合RT-PCR检测方法的应用

塔里木农垦大学乔军、解放军大学夏咸柱、东北农业大学何宠彬等对此课题进行了研究。他们利用犬瘟热(CDV)和犬冠状病毒(CCV)牧异性引物对同一样品中CDV和CCV的RNA模板进行联合RT—PCR扩增，并优化其扩增条件，得到两条大小与试验设计完全相符的特异性扩增带，且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、轮状病毒的核酸。其敏感性试验表明：该联合PCR能检测出10^-4倍稀释的CDV模板(10^6.6TCID50／0．1mL)。对7份临床发病犬病科检测，其阳性检出率可高于电镜负染检查。这表明此法有高度敏感、特异、准确、快速等特点，适用于当前民用和军用兽医临床对CDV、CCV的检测和对犬的其他疾病的鉴别诊断。

定量RT-PCR及其在植物学研究中的应用

定量RT-PCR(Quantitative reverse transcriptase-PCR)是在反转录和定量PCR的基础上发展起来的一种特异性检测基因表达的技术。主要包括相对定量RT-PCR(Relative quantitative RT-PCR)、竞争性定量RT-PCR(Competitive quan-titative RT-PCR)、比较定量RT-PCR(Comparative quantitative RT-PCR)和实时定量RT-PCR(Real time quantitative RT-PCR)四种。目前定量RT-PCR在植物学研究中的应用越来越广泛,如植物营养学研究、植物发育学研究、植物抗逆机理研究、转基因植物的检测、病原菌的检测、植物与微生物互作机理研究、植物抗病性检测等方面。本文综述了定量RT-PCR的原理及在植物学中的应用。

李矮缩病毒RT-PCR方法建立及检测应用

以感病和健康指示植物GF305的总RNA为模板,进行cDNA的合成和PCR扩增,结果从感病材料中扩增出与预期的172bp大小一致的目的片段,而健康的材料无此扩增产物。对此PCR扩增产物克隆测序,进一步佐证了RT-PCR检测结果。经过多次试验验证该检测体系,都可得到很好的重演性,从而建立了李矮缩病毒快速、灵敏、准确的RT-PCR检测技术,并进行了实际应用。

人隐孢子虫RT-PCR-ELISA检测方法的建立

目的建立一种高度敏感和特异的人隐孢子虫的RT-PCR-ELISA检测方法。方法根据人隐孢子虫与其他隐孢子虫粘附蛋白p23基因的多重比对,设计一对引物(其中p1引物带有生物素标记)用来扩增含高变区目的片段;采用RT-PCR方法扩增目的片段,扩增产物与探针引物进行液相杂交,将杂交产物与微孔板上包被的链霉亲和素结合,再与辣根过氧化酶标记的抗地高辛抗体反应。用所建立的方法对22份临床样本进行检测,并与常规检测方法进行比较。结果所建立的RT-PCR-ELISA检测方法具有高特异性和敏感性,比常规的PCR方法灵敏度提高了100(0.08:8ng)左右。临床检测结果显示,该方法的检出率高达86%(19/22),而RT-PCR、蔗糖漂浮法和抗酸染色法的检出率仅为27%(6/22)、27%(6/22)和50%(11/22)。结论本试验成功建立了人隐孢子虫的RT-PCR-ELISA检测方法,检出率比常规检测方法高。

检测禽流感病毒RT-PCR一步法的建立及H5、H9亚型的鉴定

目的建立禽流感病毒(AIV)通用型RT-PCR一步法,并鉴定AIV H5和H9亚型。方法根据流感病毒高度保守的M1基因序列,设计一套通用型引物,建立AIVRT-PCR一步法。根据H5、H9亚型HA基因序列,分别设计一套特异性引物,其上、下游引物分别位于裂解位点两侧,应用RT-PCR一步法检测AIV H5和H9亚型,并验证所建立方法的敏感性;通过检测NDV、IBV和IBDV等RNA病毒及计算机软件模拟检测,验证其特异性。结果所建立AIV系列RT-PCR检测方法具有特异、敏感、简便和快速的特点。结论该方法可用于AIV的检测,H5、H9亚型的鉴定及致病性分析。

利用RT-PCR检测柑桔碎叶病毒的研究

柑桔碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV) 的传统检测方法是指示植物测定,该方法检测周期较长,且需要温、网室等配套设施;酶联免疫吸附方法(ELISA)可用于检测CTLV,但使用的是针对苹果茎沟病毒(ASGV)的抗体,虽然CTLV和AS- GV的亲缘关系已经得到证实,但到目前为止没有对中国的分离株进行实验验证,这在一定程度上影响了结果的可靠性。本研究应用Halistones 等建立的半巢式RT-PCR技术对已感病柑桔品种进行了周年检测,现将研究结果报道如下。

实时荧光RT-PCR一步法检测番茄环斑病毒

根据番茄环斑病毒 (ToRSV)各株系RNA1聚合酶基因的保守序列 ,设计并合成 1对引物和 1条TaqMan荧光探针 ,建立了对ToRSV的实时荧光RT PCR检测方法。该方法利用TaqMan荧光探针实时监测目的基因的扩增 ,实现RT PCR扩增与探针检测同时进行 ,不需PCR后处理 ,消除了PCR产物的污染 ,不需电泳和EB染色 ,减少了检测步骤 ,节省了时间。这个方法具有“灵敏、准确、简便、快速”的特点适合于种传病害的快速诊断和口岸检验检疫运用。

马铃薯X病毒的RT-PCR检测

通过对“一步法”RNA提取方法的改进,简化了提取程序,并保证了RNA的质量。根据马铃薯X病毒(PVX)基因序列设计合成了一对特异性引物,运用反转录PCR(RT-PCR)对PVX-RNA进行扩增,成功得到了与预期大小相一致的308 bp片段,而对照未得到任何产物,同时对反转录酶AMV用量做了不同的处理,得出AMV仅用1u仍能得到较好扩增的效果。从而建立了经济简便的PVX的RT-PCR检测体系,为PVX的防治、脱毒苗的检测提供有效手段。

凤仙花坏死斑病毒的RT-PCR和巢式PCR检测

根据凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot tospovirus,INSV)S RNA上的核衣壳蛋白(N)基因序列(登录号为AB109100)保守区设计了3对特异性引物。应用常规RT-PCR和巢式PCR方法从表现同心圆症状的文心兰植株上检测得到了预期DNA片段,且巢式PCR检测灵敏度比常规PCR高。序列分析结果表明,该病毒的N基因序列和已经发表的凤仙花坏死斑病毒(登录号为AB109100、AB207803、DQ425096)核苷酸序列同源性为99%,确定表现同心圆症状的文心兰上携带了凤仙花坏死斑病毒。

兔出血症病毒2型的VP60基因保守区人工合成及RT-PCR检测方法初探

为建立用于兔出血症病毒2型(RHDV2)的快速检测方法,根据Gen Bank已公布的RHDV和RHDV2VP60基因,设计合成2对特异性引物和10条末端重叠引物,通过重叠PCR人工合成RHDV2 VP60基因中保守区片段,构建重组质粒,并以其为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验和35份样品检测应用,初步建立RHDV2 RT-PCR检测方法。实验成功合成RHDV2 VP60基因的435 bp保守片段并构建了p MD-19T-RHDV2重组质粒,初步建立的RHDV2 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,RHDV2的检测限度可达到230个拷贝的靶基因片段,检测RHDV、p GM-T-EBHSV(已构建)、兔巴氏杆菌、兔源大肠埃希菌和沙门氏菌均无特异性扩增,样品检测结果显示样品中RHDV2核酸阴性。该研究为中国及时进行RHDV2的防控提供技术储备。

荧光定量PCR与RT-PCR技术检测HCV-RNA的比较观察

目的 比较荧光定量 ＰＣＲ与ＲＴ－ＰＣＲ（定性）检测不同检材中的 ＨＣＶ－ＲＮＡ，评价荧光定量ＰＣＲ技术测定ＨＣＶ－ＲＮＡ水平的价值。方法 采用荧光定量ＰＣＲ及 ＲＴ－ＰＣＲ（定性）技术同时检测了７１例血液透析患者的血清、血浆、淋巴细胞、尿液标本中 ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果 血清、淋巴细胞、尿液标本中 ＨＣＶ－ＲＮＡ的荧光定量 ＰＣＲ检出率（４６．３８％、８５．５１％、８０．００％），分别高于相应标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ（定性）阳性率（２４．６４、２８．９９％、２０．００％），有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。血清、淋巴细胞中同时检出ＨＣＶ－ＲＮＡ的一致率，荧光定量ＰＣＲ法（３９．１３％）显著高于ＲＴ－ＰＣＲ定性法（８．７０％）（Ｐ＜０．００１）。ＨＣＶ－ＲＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ定性阳性率不随 ＲＮＡ定量水平均高而增高。结论与 ＲＴ－ＰＣＲ（定性）相比，荧光定量ＰＣＲ技术检测

联合PCR诊断大熊猫犬瘟热和犬冠状病毒的混合感染

采用一步法提取大熊猫肝脏细胞总RNA,经反转录,选择CDV和CCV联合PCR引物,一次性扩增出CDV和CCV目的片段,进一步证明了大熊猫同时感染了CDV和CCV。

BVDV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法与RT-PCR方法的建立与应用

利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。通过对RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行检测。结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出250 bp的特异性片段,对牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腺病毒、呼肠孤病毒的扩增结果均为阴性,对BVDV C24V株、GSTZ株、Av69株、S183株和BVDVⅡ型扩增结果为阳性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,RT-PCR的灵敏性为10-1TCID_(50)/mL,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的灵敏性为3.4×102copies/μL。应用2种方法对临床血清样本进行检测,结果比病毒分离方法更为敏感,操作简便。表明建立的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的流行病学监测、实验室检测以及诊断。

犬腺病毒、犬细小病毒联合PCR方法的建立与应用

根据GenBank报道的犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)序列,设计两对联合PCR引物,其中一对为CAV-1和CAV-2通用引物,另一对为CPV引物。在建立单项PCR基础上,通过优化Mg2+离子浓度和循环参数等反应条件建立联合PCR,确定联合PCR条件为:96℃180s,96℃30s,56℃30s,72℃80s,30个循环。联合PCR结果显示:CAV-1扩增片段大小为497bp,CAV-2为1019bp,CPV为719bp;细胞和其它相关病毒对照均无扩增带。上述PCR产物经用限制性内切酶酶切和克隆测序,结果均与相应病毒的应有条带和序列相同。敏感性比较试验结果表明,联合PCR比用细胞培养分离病毒敏感。将联合PCR应用于15份CAV和CPV细胞培养物,5份CAV-1、1份CAV-2和3份CPV人工感染犬病料以及30份临床病料检测,并与电镜负染、HA/HI及病毒分离等方法的结果进行比较,结果显示,联合PCR的检出率和病毒分离结果一致,高于电镜负染和HA/HI试验。以上结果说明:CAV-1/CAV-2和CPV联合PCR不仅具有很好的特异性和敏感性,而且可以在短时间内(2 5h～3h)同时鉴定出上述三种病毒,因此具有良好的实验室诊断和临床应用价值。

番茄褪绿病毒RT-PCR检测技术的优化及河南分离物的鉴定

为获得高效、灵敏和稳定的番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)RT-PCR检测体系,选取文献报道的和重新设计的共9套ToCV的RT-PCR引物,经过一系列测试和比较,筛选出了灵敏度、特异性均较高的引物组合,并对反应条件、参数进行了优化,确定了最优反应条件。应用优化的ToCV RT-PCR检测体系对从河南设施蔬菜生产区采集的疑似感病番茄样品进行检测,扩增产物测序后经BLAST比对发现,河南分离物的CP和HSP70基因序列与GenBank上注册的ToCV典型分离物序列的相似性均达94%以上,通过对ToCV病毒粒子的电镜观察而进一步确定ToCV已在河南侵染设施番茄。

西尼罗病毒的RT-PCR检测与鉴定

建立西尼罗病毒敏感、特异、快速的RTPCR检测方法用于实验室诊断和流行病学监测。采用一步RTPCR和套式PCR法对西尼罗病毒感染的乳鼠脑和细胞培养上清进行扩增,并对扩增产物进行序列测定。两种方法均可分别从两种组织中扩增出与预期大小相一致的片段,套式PCR法比一步RTPCR法更为敏感,该扩增片段与西尼罗病毒埃及Eg101株相应序列的同源性为99%。