原子转移自由基聚合制备新型接枝聚α-D-吡喃半乳糖苷色谱固定相及其性能

以2-溴异丁酰溴为引发剂,CuCl/CuCl2/Me6TREN为催化体系,在室温条件下采用原子转移自由基聚合(ATRP)法将单体6-O-甲基丙烯酰基-1,2,3,4-双-O-亚异丙基-α-D-吡喃半乳糖苷(6-O-methacryloyl-1,2,3,4-di-O-isopropylidene-α-D-galactopyranose,MAIPGal)接枝到5μm大孔硅胶表面上,得到了新型接枝聚合物(pMAIPGal)色谱固定相.考察了单体的合成过程、分离性能以及乙腈、甲醇对溶质保留行为的影响,并采用红外光谱和元素分析对固定相进行了表征.经元素分析测得该聚合物填料的接枝链密度达0.818 mg/m2.在反相色谱模式下,该固定相可基线分离7种酚类化合物和4种胺类化合物.与C18反相柱相比,该合成柱的分离时间较短且分离效果较好.同时,流动相中有机溶剂的含量对酚类和胺类化合物的保留行为有较大的影响,随着流动相中有机溶剂含量的增加,该类化合物的保留减弱.实验结果表明,该填料具有良好的色谱性能.

离子色谱法测定婴幼儿乳粉中低聚半乳糖含量

建立了一种准确测定婴幼儿配方乳粉中低聚半乳糖含量的离子色谱-脉冲安培分析方法。样品以水超声溶解提取,用乙腈沉降蛋白后经OnGuard^(TM)ⅡRP柱净化,经PA20离子色谱柱分离,脉冲安培检测器测定。用3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖标准品溶液来定性低聚半乳糖标准溶液中的低聚半乳糖二糖色谱峰,并以此峰作为定量峰,外标法定量。该方法前处理简单、快速,准确度高,稳定性好,可满足婴幼儿乳粉中低聚半乳糖含量的测定要求。

对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖法测定饲用α-半乳糖苷酶(黑曲霉)活力的方法

旨在建立一种适合于测定饲用α-半乳糖苷酶活力的检测方法。实验利用对硝基酚 -α- D-吡喃半乳糖(p- NPG)作为酶反应底物 ,通过 4 0 0 nm比色检测酶反应所释放的对硝基酚的量来测定饲用酶制剂中 α-半乳糖苷酶的活性。研究表明 ,反应液中所含的对硝基酚的量大于 15 μmol.m L-1时 ,吸光值超过仪器的检测范围 ;酶制剂稀释倍数对对硝基酚比色法的影响较小 ,本底占总酶活的 10 %～ 16 % ,当酶稀释 10 0倍时 ,本底对酶活的影响最小 ;在测定酶活反应时间为 6 min时 ,已经有约 10 %的对硝基酚 - α- D-吡喃半乳糖水解 ,当酶液的酶活在 2 .0 U.m L-1以内 ,测试结果较为准确。考虑到饲用酶制剂的作用环境 ,建议反应温度为 37℃、反应体系 p H 5 .0。

芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶的性质及其在合成低聚半乳糖中的应用

低聚半乳糖是一种重要的益生元,芽孢杆菌(Bacillales sp.)来源的β-半乳糖苷酶具有转半乳糖苷活性,能合成低聚半乳糖。研究了一个新的芽孢杆菌来源的β-半乳糖苷酶的表达、酶学性质及其在合成低聚半乳糖中的应用。从芽孢杆菌中克隆了一个糖苷水解酶35家族的β-半乳糖苷酶基因(BABgal35A),并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。多重序列比对结果表明:BABgal35A与环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)来源的β-半乳糖苷酶同源性最高,为79.9%,是一个新型的β-半乳糖苷酶(命名为BABgal35A)。粗酶液经Ni-IDA亲和层析纯化得到电泳级纯酶,蛋白电泳分析表明其分子质量为60 kDa左右,最适pH值和温度分别为5.0和55℃,并且该酶在pH值为4.5~8.0,温度为20~45℃时稳定性好。BABgal35A对o NP-β-galactopyranoside具有较高的催化活性。该酶以乳糖为底物合成低聚半乳糖的产率达34%。研究结果表明,芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖的制备中具有潜在的应用价值。

影响kluyveromyces fragilisβ-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的因素

研究了酶反应的温度、pH值、底物浓度和反应时间等对kluyveromycesfragilisβ-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的影响.结果显示,以乳糖为底物,kluyveromycesfragilisβ-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最适温度为60℃,最适pH值为6.0.酶法合成低聚半乳糖的产率随着底物浓度增加而增加.kluyveromycesfragilisβ-D-半乳糖苷酶催化低聚半乳糖合成的初速度较快,随着反应时间延长,反应速率降低,反应20h酶反应达到平衡.以660mg/mL乳糖为底物,在最适酶反应条件下,酶法合成低聚半乳糖的产率为207.12mg/mL.

静电纺丝制备苯乙烯马来酸酐共聚物纳米纤维及其固定化β-D-半乳糖苷酶

采用静电纺丝技术制备苯乙烯-马来酸酐共聚物纳米纤维,最佳电纺条件为:聚合物浓度0.35g/mL、针尖到接收板距离25cm、电纺液流量250μL/h、电压21kV.该条件下获得了直径约300nm且分布均一的纳米纤维.利用该纳米纤维固定β-D-半乳糖苷酶,固定化反应的最适pH值为4.0,此时酶负载量为(15.1±0.5)mg/g.固定化酶催化2-硝基苯酚-β-D-半乳吡喃糖苷水解反应的米氏常数K_m=2.7mmol/L,略大于游离酶的K_m值(2.2mmol/L);最大反应速率V_(max)为97.2μmol/(min·mg),为游离酶的47.8%.固定化酶在37℃下重复操作21次后活性损失仅为15%.在连续搅拌式反应器中将固定化酶用于催化乳糖的水解反应,连续使用17d仍能稳定运行.

3-叠氮基丙基-β-D-吡喃半乳糖苷的合成工艺改进

以D-半乳糖为原料,经苯甲酰化制得1,2,3,4,6-五-氧-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(2);2与3-氯丙醇在三氟化硼乙醚作用下进行糖苷化反应制得3-氯丙基-2,3,4,6-四-氧-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(3);3与叠氮钠反应制得3-叠氮基丙基-2,3,4,6-四-氧-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(4);4在甲醇钠作用下脱苯甲酰基合成了3-叠氮基丙基-β-D-吡喃半乳糖苷,总收率67.8%,其结构经1H NMR和ESI-HR-MS确证。

转糖基β-半乳糖苷酶产生菌筛选和鉴定及酶催化生成低聚半乳糖

通过水解活性和转糖基活性筛选,从实验室97株保存菌种中获得1株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌,克隆并序列分析了该菌株16S rDNA基因片断,GenBank收录号为DQ267829.综合其形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析结果,将其鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)2-37-4-1.确定了该菌株β-半乳糖苷酶产酶培养基的碳源为乳糖1%,氮源为蛋白胨0.5%和酵母膏0.5%,培养条件为37℃摇床培养18 h;碳源实验证明,该菌株β-半乳糖苷酶产生为乳糖诱导型.利用薄层层析技术研究了pH值、乳糖底物浓度、反应温度和反应时间对该菌株β-半乳糖苷酶以乳糖为底物转糖基合成低聚半乳糖的影响,确定最适反应条件为pH7.5、50 mmol/L(磷酸缓冲液)配制的40%乳糖溶液,55℃反应24 h.转糖基反应产物高压液相色谱分析其组成为低聚半乳糖25.68%,双糖(包括乳糖和转移二糖)33.02%,葡萄糖26.37%和半乳糖14.92%.

米曲霉β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

研究了温度、ｐＨ、酶量和起始乳糖浓度对低聚半乳糖合成的影响，发现乳糖水解为单糖和合成低聚糖所需的最佳条件并不相同；利用有机溶剂作反应介质有利于低聚糖合成。在疏水性环己烷／水（９５／５，Ｖ／Ｖ）反应体系中得到的低聚糖浓度为５２．６ｇ／Ｌ，占总产物的３９．１９％；在亲水性乙酸乙酯／水（８０／２０，Ｖ／Ｖ）体系中得到低聚糖的浓度为４０．０４ｇ／Ｌ，占总产物的３９．６２％。另外，疏水性有机溶剂抑制低聚糖水解的能力强于亲水性溶剂。

米曲霉β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的工艺研究

研究了反应时间、乳糖浓度、温度、加酶量、pH对低聚半乳糖合成的影响,结果表明,加酶量、乳糖浓度、反应温度的影响较大。通过正交实验确定的米曲霉β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最佳工艺条件为:pH6.0、温度55℃、乳糖浓度40%、加酶量40U/g、反应时间32h。在最佳工艺条件下,低聚半乳糖的合成率为32.4%。

固定化β-半乳糖苷酶催化生成低聚半乳糖

研究了聚丙烯酰胺包埋后的乳糖酶的基本酶学性质和 pH、温度、反应时间、起始乳糖质量分数和酶用量对固定化酶合成低聚糖的影响。得到填充床式连续反应优化反应条件为 4 0 %的乳糖质量分数 ,反应温度 5 5℃ ,pH 5 5 ,反应停留时间 4 5min ,酶用量 30U/g乳糖。得率可达 4 0 %

转糖基β-半乳糖苷酶产生菌Enterobacter agglomerans B1:筛选鉴定、发酵产酶及其合成低聚半乳糖的研究

从土壤中筛选获得一株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌,综合其形态学特征、生理生化特征及16SrDNA序列同源分析结果,将其鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)B1。通过单因子试验和正交试验,对B1菌株产转糖基β-半乳糖苷酶的培养条件进行了优化。最佳培养基主要组份为:乳糖1%,酵母粉1%,蛋白胨0.5%;发酵条件为:初始pH7.5,发酵温度25℃,发酵时间26h。在该培养条件下产酶量为9.7U/mL。利用薄层层析技术研究了pH、温度、底物浓度和反应时间对该菌株全细胞以乳糖为底物生成低聚半乳糖的影响,确定最适反应条件为:pH7.5缓冲液配制的30%乳糖溶液;50℃反应12h。最优化反应的转糖基产物经HPLC、TLC和MS分析,确定低聚半乳糖产量为40.7%,组分为转移二糖、三糖和四糖。

β-半乳糖苷酶酶学性质及其在低聚半乳糖合成中的应用

研究乳酸克鲁维酵母所产β-半乳糖苷酶的酶学性质及低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)的酶法合成条件。利用高效液相色谱法进行检测,以GOS(聚合度n>3)生成量为指标,考察温度、pH、金属离子种类和浓度对酶活性的影响,以及K+存在时,底物浓度、反应时间、加酶量对乳糖转化率及GOS生成浓度的影响。结果表明:一价离子对β-半乳糖苷酶转糖苷活性具有促进作用,其中K+、NH+4对水解活性同样起促进作用,而Na+起抑制作用;制备低聚半乳糖的最佳工艺条件为37℃、pH8.0、K+0.08mol/L、初始乳糖质量浓度500g/L、反应时间5h、加酶量10μL/g乳糖,此条件下低聚半乳糖的生成质量浓度达到94.74g/L。

产β-D-半乳糖苷酶马克斯克鲁维酵母的分离鉴定及其产酶特性

从藏灵菇中分离筛选到的一株高产β-D-半乳糖苷酶菌株ZX-5,经ITS DNA序列分析,鉴定为马克斯克鲁维酵母。对产酶培养基的最佳碳源和氮源优化结果为半乳糖2.0%,胰蛋白胨1.0%;产酶优化条件:温度30℃,培养基初始pH 6.5,装液量30%,转速100 r/min,接种量2.0%,发酵36 h。粗酶液酶活力为2.60 U/mL;经硫酸铵分级沉淀和DEAE离子交换层析,获得纯化酶的比活力为157.35 U/mg。酶最适反应温度35℃,最适pH 6.0,在20~40℃和pH 5.0~7.0的范围内酶的稳定性较好;Mn2+对酶的活性有促进作用。利用菌株ZX-5β-D-半乳糖苷酶分解乳糖并合成低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide,GOS),在35℃、乳糖质量浓度60 g/100 mL、酶浓度1.0 U/mL条件下,乳糖水解率达68.34%(50 h),GOS产率达34.70%(40 h),具有潜在的应用前景。

转糖基β-半乳糖苷酶生产含低聚半乳糖的低乳糖牛奶

研究利用具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶生产含低聚半乳糖的低乳糖牛奶。含低聚半乳糖的低乳糖牛奶既能解决乳糖不耐症问题,同时还在牛奶中增添了低聚半乳糖双歧因子。从Enterobacter sp．B5的无细胞抽提液中,利用硫酸铵沉淀制备具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶,作用鲜牛奶生成含低聚半乳糖的低乳糖牛奶。利用薄层层析、高压液相色谱技术和软件NIH ImageJ 1．36分析了反应产物中的糖组分(葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚糖(包括转移二糖和三糖))。结果显示酶作用后的鲜牛奶中大约70%的乳糖转化为葡萄糖和半乳糖,至少10%的乳糖通过转糖基反应生成低聚半乳糖。在酶浓度为3U/ml,50℃酶解4h的反应条件下,获得含低聚半乳糖的低乳糖牛奶的糖组成为0．59%低聚半乳糖(含0．37%转移二糖和0．22%三糖),1．33%乳糖,2．83%单糖。本研究利用软件NIH ImageJ 1．36定量分析样品糖组分的TLC结果,可以避免乳糖的同分异构体-转移二糖在高压液相色谱结果中因无法分离而造成的漏检。

β-D-吡喃半乳糖的太赫兹光谱研究

为深入了解β-D-吡喃半乳糖在太赫兹波段的光谱特性,利用太赫兹时域光谱技术测量了室温下β-D-吡喃半乳糖晶体在0.3～3.0THz范围内的吸收谱及折射率谱,同时利用傅里叶变换红外光谱技术获得了半乳糖在1.5～19.5THz之间的吸收谱。实验研究的同时,运用密度泛函理论和6-311+G**基组计算了气态孤立β-D-吡喃半乳糖分子的结构及其在太赫兹波段的振动频率,并据此对实验光谱吸收峰进行了指认。研究结果表明,除了因为分子间效应而导致的少许偏移外,理论计算结果与实验数据吻合得很好;实验光谱在6THz以上频段的共振吸收峰来源于明确的分子内振动模式,而6THz以下低频段的共振吸收峰则主要来源于分子间氢键或晶体的声子模式。实验和理论研究的对比表明物质的远红外吸收特征对于分子的结构和空间排列非常敏感。

熊猫豆β-D-半乳糖苷酶的基本性质研究

经硫酸铵分级分离 ,DEAE- cellulose5 2 ,CM- cellulose5 2和 Sephacryl S10 0 HR凝胶过滤层析方法从熊猫豆黄化苗中获得了一种β- D -半乳糖苷酶 ,活性收率为 8.0 % ,纯化倍数为 2 4 5 .经PAGE显示单一蛋白着色带 ,用 IEF- PAGE测定其 PI为 4 .1.SDS- PAGE显示 2条蛋白着色带 ,其相应分子量分别为 4 0 k D和 2 9k D.Sephadex G2 0 0层析法测得表观分子量为 6 8k D.以 ONPG和PNPG为底物测得该酶的表观 Km 分别为 3.0 2 mmol/ L和 0 .33mmol/ L.最适 p H为 4 .2 ,最适温度为 5 2℃ .以乳糖为底物测得表观 Km 为 4 3mmol/ L.Hg CI2 ,DTNB,NEMI,半乳糖和乳糖对酶表现出不同的抑制作用 .

乳糖诱导大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶试验

大肠杆菌是是重要的使人罹患疾病的食源性病原微生物之一,也是重要的食品被动物排泄物污染的指标。大肠杆菌在其生长过程中会产生β-D-半乳糖苷酶,这种酶常被用于进行大肠杆菌的快速检测。本试验是探索乳糖诱导大肠杆菌产生β-D-半乳糖苷酶的最佳条件,缩短基于酶检测技术检测大肠杆菌的时间。通过单因素试验确定培养基中加入乳糖的浓度、剂量和培养时间,用L9(34)正交表设计试验因素水平,以β-D-半乳糖苷酶活力OD值为判定指标,确定乳糖诱导大肠杆菌产生β-D-半乳糖苷酶的客观条件。结果于10 m L大肠杆菌培养液中添加0.5%乳糖1 m L,诱导时间为4 h时所诱导的β-D-半乳糖苷酶量最多。说明恰当的乳糖浓度能很好地诱导大肠杆菌短时间产生β-D-半乳糖苷酶,并因此可以明显缩短利用该酶检测大肠杆菌的时间。

茶叶中β-D-半乳糖苷酶活性分析条件的优化及其在不同季节、嫩度和品种间的差异分析

采用单因素和正交试验设计对茶叶中β-D-半乳糖苷酶的比活力测定条件进行优化。结果表明,茶叶中β-D-半乳糖苷酶1比活力测定条件为:以pH4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠为缓冲液,在60℃下反应7min。对不同茶叶品种、生长季节以及不同嫩度叶片中的β-D-半乳糖苷酶比活力进行分析。结果表明,乌龙茶与绿茶品种中β-D-半乳糖苷酶比活力差异明显,不同季节与不同嫩度茶叶叶片之间也存在较大变化。

β-半乳糖苷酶的筛选、克隆表达、酶学性质及其酶法合成低聚半乳糖

采用人工底物邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o NPG)为筛选标记,从耐有机溶剂微生物菌库中,筛选出具有较高水解活性的β-半乳糖苷酶产生菌,再以乳糖为底物考察菌株低聚半乳糖的合成性能,筛选得到1株产β-半乳糖苷酶的Erwinia billingiae WX1。根据Gen Bank中相同属种的基因组序列推测β-半乳糖苷酶基因,克隆得到β-半乳糖苷酶基因gal,并在大肠杆菌中实现了来源于Erwinia billingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表达。该基因的开放阅读框(ORF)为1 428 bp,编码475个氨基酸,理论相对分子质量为5.2×104。镍柱法分离纯化得到电泳纯的β-半乳糖苷酶GAL,其酶学性质研究表明最适催化温度55℃,最适p H 7.0;Mg^(2+)、Mn^(2+)对该酶起较强促进作用,EDTA对该酶抑制作用较强。利用β-半乳糖苷酶GAL的转糖基作用,以乳糖为底物合成低聚半乳糖,初步优化的反应条件:底物乳糖质量浓度400 g/L,每克乳糖添加酶量1.0 U,在40℃反应16 h后,低聚半乳糖合成率达到34%(质量分数),显示了较好的开发前景。