聚丙烯酰胺凝胶DNA水平电泳检测多药耐药基因多态性

目的探讨聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)DNA水平电泳条件,分析多药耐药基因单核苷酸多态性(MDR1SNPs)。方法以DNA标准为标本探讨PAGE DNA水平电泳条件;PCR-限制性片段长度多态性作为健康人MDR1SNPs C3435T分析,PAGE DNA水平电泳作PCR产物酶切结果分析。结果10 mL PAGE含40%过硫酸铵70μL,四甲基乙二胺20μL,隔绝空气在琼脂糖水平电泳槽制胶。交联度为29:1,凝胶浓度为7.5%时,效果最好。45例健康人MDR1C3435T中,20例为C/C型、T/C型17例、T/T型8例。结论PAGE DNA水平电泳简便易行,分离效果好,可用于MDR1SNPs分析,适合基层推广。

基于水凝胶的基因组DNA固定法研究

目的:通过对人基因组DNA固定化的研究,探讨特异性高的单点共价固定方法,实现对人基因组DNA的反复利用。方法:选取Mirzabekov等发明的DNA-水凝胶共聚化学法作为基因组DNA固定方法,使用甲基丙烯酰胺凝胶作为固相支持载体,以(CH2)6-NH2氨基末端修饰的PCR产物及甲酸随机断裂修饰的pGEM-T-HLA-G质粒为模板,使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其固定效率,并通过PCR法检测该固定方法的热稳定性。将该法初步应用于人类基因组DNA的固定和反复利用,对基因组DNA扩增的片段进行测序,排除突变可能。结果:使用甲基丙烯酰胺凝胶作为固相支持载体,实现了对质粒DNA以及人基因组DNA的固定和反复使用,该方法可以经受16轮的PCR扩增(每轮36个循环)。测序结果证实基因组DNA的扩增片段未发生突变。结论:甲基丙烯酰胺凝胶法固定DNA的热稳定性好,特异性高,可用于全基因组测序及SNP检测。

可溶性猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取与鉴定

目的从猪膝关节软骨中提取纯化Ⅱ型胶原蛋白,并对其进行鉴定。方法选择猪膝关节软骨为提取原料,用盐酸胍去除蛋白多糖、胃蛋白酶两步消化、氯化钠盐析、超纯水透析、离心浓缩等方法提取纯化Ⅱ型胶原蛋白;采用SDS-PAGE、氨基酸成分分析对提取的Ⅱ型胶原蛋白进行鉴定;利用冻干的方法计算提取的浓度。结果 SDS-PAGE电泳结果显示提取的Ⅱ型胶原蛋白分子量约120 kD;氨基酸成分分析显示甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸含量最高,并且可以检出羟脯氨酸、羟赖氨酸,符合Ⅱ型胶原特征;该法提取的Ⅱ型胶原蛋白浓度为66 mg/mL。结论从猪关节软骨提取的Ⅱ型胶原蛋白纯度高,方法简便,提取的胶原蛋白浓度更高。

婴幼儿轮状病毒无症状感染的研究

轮状病毒是世界范围内婴幼儿腹泻病最重要的病原之一.任何年龄的人都可感染轮状病毒,但有症状感染主要发生在婴幼儿期,3岁以后轮状病毒肠炎的发病率明显下降.有研究表明,到5岁时,几乎所有的儿童都感染过轮状病毒,而实际上婴幼儿期并非100%患过轮状病毒肠炎.据此推测有相当数量的婴幼儿呈无症状感染.

人晶状体蛋白的质谱分析

目的:应用质谱法检测人晶状体蛋白质组成。方法:完整晶状体预分离后再通过1D SDS-PAGE凝胶分离晶状体蛋白质,依照考马斯亮蓝染色后的结果分成条带后进行胶内酶解,酶解后的肽段通过反相液相色谱再次分离,用线性离子阱串联质谱仪(LTQ)对洗脱出的肽段进行分析。运用生物信息学方法分析鉴定出的蛋白质。结果:共鉴定出人晶状体蛋白质574种,许多未知蛋白和蛋白亚型被鉴定出,相似于某种蛋白有38种,不确定蛋白有56种,没有特征的蛋白有27种,已知分子质量但不知功能蛋白有42种。通过生物信息学分析实验鉴定出的晶状体蛋白质数据,获得晶状体蛋白质一些重要代谢过程的结果。结论:提供大量未知人晶状体蛋白质数据及其代谢过程。

应用不同材质容器对硝酸银染色效果的影响

目的:比较使用不同材料的染色容器对蛋白质十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)银染显色速度及效果的影响。方法:以小鼠脑蛋白的SDS-PAGE为材料,凝胶分别在玻璃平皿、医用搪瓷盘和密胺塑料盘中进行银染,参照常规银染方法;同时采用一种优化的银染方法作为对照,在医用搪瓷盘中进行。银染后蛋白条带用Quantity One凝胶定量软件进行灰度值分析。结果:常规方法银染的凝胶,在玻璃平皿中显色最快,蛋白条带灰度值最高;在医用搪瓷盘中显色速度及灰度值均次之;在密胺塑料盘中显色速度及灰度值最低。对照优化方法银染的凝胶,显色速度和蛋白条带灰度值远高于常规银染的凝胶。结论:对于小鼠脑蛋白的SDS-PAGE银染,常规方法中,用玻璃平皿效果最好,医用搪瓷盘次之,密胺塑料盘最差。优化方法可以大大提高用医用搪瓷盘银染的效果。

抗IL-4R单链抗体原核表达载体的构建与表达

目的通过BL21(DE3)原核表达系统制备抗白细胞介素-4受体(IL-4R)鼠抗人单链抗体(scFv)。方法在前期研究结果的基础上优化抗IL-4R scFv序列,优化后分析scFv序列,构建重组质粒pET-32a-scFv,将该重组质粒酶切鉴定,将其转入BL21(DE3)原核表达菌进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析检测,对表达蛋白进行纯化和复性,通过SDS-PAGE分析抗IL-4R单链抗体的分子质量,运用Western blot检测融合蛋白的特异性。结果插入pET-32a载体的scFv序列长度761 bp,抗IL-4R单链抗体的分子质量在45 ku左右,重组蛋白具有较高的特异性。结论本实验成功构建pET32a-scFv原核表达系统,重组蛋白具有较高的免疫反应性,为进一步研究抗IL-4R单链抗体作为药物靶点提供了工作基础。

蛋白质组技术及其在临床医学领域的运用

后基因组时代，生命科学研究的重点已从揭示生物的遗传信息转移到功能基因组学上来。蛋白质组学作为功能基因组学研究的核心技术之一，在生物医学领域日益成为强大的技术支撑．该技术主要包括二维聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱分析、蛋白质组信息学等，在生物医学基础研究、药物开发及临床研究等诸多领域中发挥越来越重要的作用。

子宫颈癌端粒酶活性分析

目的 探讨新疆维吾尔族子宫颈癌端粒酶的活性。方法 采用 TRAP- PCR- EL ISA法和 TRAP- PCR-电泳法 ,对新疆维吾尔族子宫颈癌组织和正常组织进行了检测。结果 子宫颈癌组织中端粒酶活性的阳性检出率为 88.2 % ,而正常子宫颈组织中为 9.5 % ,癌组织较正常组织端粒酶活性明显增高。结论 子宫颈癌各病理指标临床分期均可检测出端粒酶活性 ,此现象反映了癌发展过程中的早期变化。同其他民族的子宫颈癌研究结果相同。端粒酶活性在维吾尔族子宫颈癌中也表现增高 ,因此 ,也可作为该民族子宫颈癌的一个标志物。另外 ,用 TRAP- PCR-EL ISA较 TRAP- PCR电泳法敏感性强。

子宫肌瘤蛋白质组研究中二维电泳方法的建立

目的 :建立并优化用于子宫肌瘤蛋白质组分析的二维电泳技术 ,提高其分辨率和重复性。方法 :以固相p H梯度等电聚焦为第一向 ,采用垂直十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向 ,并对关键步骤如样品的溶解、上样量、电泳参数和染色方法进行一系列的优化。结果 :获得质量较好的子宫肌瘤和正常肌层的二维电泳图谱。结论 :采用蛋白溶解度增强的裂解液分步提取组织的蛋白质 ,有利于二维电泳图谱的完整性 ;RC DC蛋白定量方法是二维电泳较为理想的蛋白定量方法 ,直接关系到上样量 ;质谱兼容银染法并不降低蛋白斑点的分辨率 ;窄范围(p H 4～ 7)的 IPG胶条较宽范围 (p H 3～ 10 )的 IPG胶条具有较高的分辨率。

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义。方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性。结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6,限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37℃,诱导剂IPTG的浓度为1mmol/L。结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。

SDS-PAGE分析嗜人按蚊中肠膜蛋白

目的:初步分析嗜人按蚊中肠膜蛋白组分。方法:采用SDS-PAGE以及银氨染色法检测嗜人按蚊中肠膜蛋白分子量,并对分子量标准(Mr116000～14400)进行直线回归分析。结果:嗜人按蚊中肠粗蛋白(C带)上有8条主带,而膜蛋白(B带)上有4条主带。Marker标准直线回归系数为-0.9814。通过电泳迁移率计算,得出膜蛋白分子量在66.2～35.48kD范围。结论:膜蛋白提取后,嗜人按蚊中肠蛋白组分进一步得到纯化。

尿蛋白电泳分析和质谱鉴定

目的探究尿蛋白的最佳沉淀方法 ,且对常规损失蛋白进行鉴定分析。方法采用有机溶剂沉淀法,即用三氯乙酸/90%丙酮法、三氯乙酸/100%丙酮法和90%丙酮法分别沉淀尿液中蛋白质,对90%丙酮法所得到沉淀的可溶部分和不溶部分进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺分离和质谱鉴定。结果 90%丙酮沉淀法获得的尿蛋白量相对较高。将90%丙酮法沉淀的尿蛋白不溶部分和可溶部分进行质谱鉴定,可溶部分得到53种蛋白,不溶部分得到49种蛋白,且不溶部分特有的蛋白包括免疫球蛋白κ轻链基因1-5、谷氨酰氨肽酶、突变体1、芳基硫酸酯酶A前体等14种。结论尿液沉淀的不溶部分中特有蛋白的发现有助于尿液蛋白质组的全谱研究,对临床特异蛋白的检测具有重要意义。

婴幼儿轮状病毒无症状感染的研究

目的在于探讨受轮状病毒感染威胁最大的婴幼儿在轮状病毒感染流行期和非流行期,不同年份、不同季节,轮状病毒无症状感染的状态及其临床意义.方法用聚烯酰胺凝胶电泳PAGE技术.1997-10/1999-03按velazguez等轮状病毒无症状感染的标准(采便前后5d内无腹泻发生)收集1mo～3岁婴幼儿粪便标本509例份.同时,用100例份临床诊断婴幼儿轮状病毒胃肠炎,且大便轮状病毒抗原阳性(ELISA法)粪便标本电泳型作对照,分析无症状感染者电泳型变化及其临床意义.结果509例份研究标本PAGE检测RV-RNA阳性94例份,无症状感染率18.47%(其95%可信区间为15.10%～21.84%).流行期无症状感染率为23.25%(93/400),非流行期0.92%(1/109),流行期明显高于非流行期(P<0.001);流行早期30.83%(41/133),流行高峰期22.06%(30/136);流行末期16.7%(22/131);流行早期明显高于流行末期(P<0.05).第一个流行年(97.10～98.3)无症状感染为32.50%(65/200);第二个流行年(98.10～99.3)为14.50%(28/200).不同流行年份无症状感染率有明显差异(P<0.001).实际上两个年份临床表现出流行规模也有差别,前一个流行年流行规模明显大于第二个流行年.婴幼儿轮状病毒无症状感染的RNA电泳型与有症状感染者电泳型一样呈多样性,且不断变化.但其电泳型主要构成与同期有症状电泳型主要构成,比较无差异性(P>0.05).结论婴幼儿轮状病毒无症状感染率(18.47%),但流行年份和流行规模不同,其无症状感染率也随之不同.

短串联重复序列位点的优选及其在脊髓性肌萎缩症产前诊断中的应用

目的优选出与运动神经元生存(survival motor neuron,SMN)基因紧密连锁且多态信息含量丰富的短串联重复序列(STR)位点,并将其应用于脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)产前基因诊断中。方法用 PCR 扩增与 SMN 基因紧密连锁的11个 STR 位点,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测,银染法显色分析结果。通过多态信息含量(PIC)大小优选 STR 位点,并利用优选出的 STR 位点分别采用 PCR-PAGE 及基因扫描技术对6个 SMA 家系(包括父母、先证者和胎儿)进行连锁分析。结果我们从11个 STR 位点中优选出了3个位点(D5S435、D5F149、D5S351),这3个位点在100名健康人中分别检测出8、19、18种多态性片段,其 PIC 值分别为0.84、0.91、0.92。应用上述3个位点对6个 SMA 家系进行产前诊断连锁分析,在6名胎儿中发现4名携带者和2名健康者。结论通过优选出的3个 STR 位点可快速进行 SMA 产前基因诊断,准确地排除母血污染,而且可在胎儿中甄别出健康个体与基因携带者,进一步完善了 SMA 产前基因诊断体系。

中耳胆脂瘤中核因子-κB的表达与活化

目的研究中耳胆脂瘤中核因子-κB(nuclearfactorkappaB,NF-κB)的表达与活化,深入阐明胆脂瘤的发病机制。方法中耳手术中收集21例中耳胆脂瘤组织及8例正常外耳道皮肤组织,分别采用免疫组化及凝胶电泳迁移阻滞法(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)检测2种组织NF-κB的蛋白表达分布及DNA结合活性,并进一步以胆脂瘤鳞屑刺激人角质形成细胞系HaCaT,观察细胞NF-κB的活性变化。结果胆脂瘤上皮组织中NF-κB的表达强度显著高于正常表皮组织,其阳性细胞平均积分吸光度分别为0·168±0·051、0·088±0·019(t=4·211,P<0·01),部分胆脂瘤(12/21)上皮细胞出现明显NF-κB的核转位;EMSA结果显示胆脂瘤组电泳带相对密度扫描值平均为(16·5±10·1)%,正常皮肤组则为(1·38±1·24)%,提示胆脂瘤组织中NF-κB的DNA结合活性显著高于正常皮肤组织(t=3·600,P=0·014);在胆脂瘤鳞屑刺激下,HaCaT细胞出现NF-κB的活化,其活性变化与鳞屑组织呈剂量依赖关系。结论NF-κB在胆脂瘤组织中存在异常活化,核因子-κB可能在胆脂瘤的发生和持续发展中起重要作用。

高通量透析膜蛋白质通透性的研究

目的评估高通量透析膜的蛋白质通透性。方法所有的透析模式均设为单纯超滤,在应用不同的透析膜透析时于透析器的出液口留取滤出液标本,同时进行蛋白质浓度测定和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)作蛋白质电泳分析。SDS-PAGE采用银染色的方法并根据Melzer的方法作了改良,结果应用激光吸光度测定仪进行条带分析。结果透析膜滤出液中蛋白质条带与经肾小球膜滤出的蛋白质相似,含IgG、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白和β2-微球蛋白。由于不同的透析膜的分子截留量、电荷和吸附能力不同,其蛋白质条带的分布亦不同。随着透析的进行,所有膜的通透性都逐渐下降。结论高通量透析膜的蛋白质通透性与肾小球滤过膜相似,但受孔径、表面所带电荷、吸附能力和透析时间的影响而发生改变。与人体的肾小球滤过膜不同,随着透析的进行,透析膜的蛋白质通透性下降。

改良PAGE电泳诊断胎儿神经管缺陷的临床应用

目的通过检测羊水乙酰胆碱酯酶(AchE)诊断和鉴别诊断胎儿神经管缺陷(NTDs)等疾病。方法采用SDS-PAGE凝胶电泳方法分离AchE。根据阳性对照判断AchE的电泳条带,并用密度仪检测AchE与假性胆碱酯酶(PchE)比值以及不同孕期(13～27周)与AchE/PchE的线性关系。结果 AchE/PchE比值≥0.139者为开放性神经管缺陷疾病(ONTDs);比值在0.034～0.139者为胎儿腹壁裂或死胎等疾病;比值在0.034以下者为非NTDs。孕期在15～25周与AchE/PchE有一定的线性关系(r=0.9595)。结论采用羊水电泳检测AchE,可作为唐氏筛查的补充实验,用于临床诊断和鉴别诊断胎儿NTDs等疾病。

应用串联质谱法对成年男性正常晶状体纤维进行蛋白质组分析

目的建立成年男性正常晶状体纤维蛋白表达谱。方法晶状体纤维总蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳初步分离、胶内酶切后的多肽利用反相液相色谱串联质谱的方法，对成年男性正常晶状体中的全部纤维蛋白质进行鉴定。根据高丰度离子的匹配率、匹配离子的连续性和随机性评分，通过SEQUEST和AMASS软件筛选结果。同一样品重复进行3次实验，具有可信度〉98％、有2个或2个以上合格谱图、不少于2次实验均鉴定的蛋白质作为阳性结果。结果实验室共鉴定60个蛋白质，有22个晶状体蛋白质在以前的晶状体蛋白质组研究中有过鉴定。结论该研究建立了成年男性正常晶状体纤维蛋白质表达谱。聚丙烯酰胺凝胶电泳与液相色谱串联质谱相结合是简单、高灵敏度的蛋白质组学方法，适用于研究晶状体纤维的蛋白质随年龄及白内障形成过程中的变化。

20cm与8cmSDS—PAGE检测钙ATP酶同工异构体分子量比较

目的比较在蛋白质组学中使用的20cmSDS—PAGE和传统的8cmSDS—PAGE在细胞膜钙ATP酶（PMCA）同工异构体表观相对分子质量测量的差异。方法人品状体上皮细胞（HLEB-3细胞）经培养至90％融合后，收集其膜蛋白。部分样品行20cmSDS—PAGE，条件为16mA／gel，然后改为24mA／gel，共4～5h。另一部分样品行8cmSDS—PAGE，条件为200V45min。在同一胶上同时电泳已知相对分子质量的蛋白质标记物。分离厚的蛋白转移到PVDF膜上，用针对细胞膜钙ATP酶（PMCA）同工异构体PMCA1、PMCA2和PMCA4的特异性抗体进行Western印迹检测。通过电泳移行距离与对数相对分子质量的线性关系计算各个同工异构体的表观相对分子质量。结果从电泳条带的形态上看，8cm胶中蛋白条带较细而浓集，而20cm胶中较宽而扩散。在8cm胶208000和126000条带之间的距离为6．1mm，而在20cm胶此距离为32．8mm。在8cm胶126000和97000条带之间的距离为5．2mm，而在20cm胶为20．2mm。20cm胶中各蛋白条带的移行距离较8cm胶增加。但是存8cm胶中蛋白质条带的浓集性较好。在8cm胶中PMCA1、2、4的表观相对分子质量分别为153800、153500和152900；在20cm胶中，则分别为153100、125500和147400。结论首次证实20μm和8cmSDS—PAGE均能成功检测HLEB-3细胞中PMCA1、2、4的存在，但是检测出的表观相对分子质量有所不同。PMCA1、2、4的相对分子质量在8cm胶中分别为153800，153500和152900，而在20cm胶中分别为153100，125500和147400。PMCA2很可能在20cm胶长时间的电泳过程中发生了蛋白水解现象。