聚乙二醇化尿酸氧化酶有抗高尿酸血症活性

根据在欧洲抗风湿学会年会上公布的Ⅱ期研究的结果，Savient制药公司的聚乙二醇化尿酸氧化酶（PEG-urateoxidase）（Ⅰ）在难治性痛风患者中显示有抗高尿酸血症活性。这项公开标签、多中心的研究共纳入41例高尿酸血症和重症痛风患者，他们对传统治疗无应答或不能耐受，随机接受静脉输注（Ⅰ）4mg／2周（7例）、8mg／2周（8例），8mg／4周（13例）或12mg／4周，为期12周。所有剂量组都有50％以上的患者达到平均血清尿酸水平低于6mg／dL，8mg／2周组的比例达到80％。

不同分子量聚乙二醇及其修饰的重组尿酸氧化酶对体外不同类型细胞产生空泡的影响研究

[目的]探究不同分子量的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)及其修饰的重组尿酸氧化酶(recombinant urate oxidase,rUOX)对体外不同类型细胞产生空泡的影响。[方法]离体培养人主动脉内皮细胞系(HAEC)、人胚肾细胞株(293细胞)以及仓鼠卵巢细胞亚株(CHO-K1),应用分子量为5kD和20kD的PEG及其修饰的rUOX,分别给药于上述细胞,观察细胞产生空泡的现象并对其进行评分,应用ELISA检测PEG或PEG修饰的药物是否进入细胞内。[结果]活化前后的PEG20k和PEG5k均导致293细胞产生大面积的空泡,ELISA显示PEG进入该细胞内,其他组无明显差异。[结论]这种体外空泡的产生局限于不同类型的细胞,与PEG分子本身有关,可能与所耦合的蛋白药物无关,且活化前后的PEG均能产生这种空泡。

高碘酸氧化-还原胺化法对尿酸酶的聚乙二醇化研究

采用高碘酸氧化-还原胺化法对尿酸酶的N端氨基进行聚乙二醇修饰研究。首先,以相对分子质量为20 k D的单甲氧基聚乙二醇氨基盐酸盐(m PEG20000-NH2·HCl)和N-叔丁氧羰基-L-丝氨酸(Boc-Ser-OH)为原料通过酰胺化反应制备聚乙二醇中间体,然后由三氟乙酸(TFA)作用脱去Boc基团获得目标产物Ser-m PEG20000,该化合物经高碘酸钠氧化生成具有较高活性的聚乙二醇醛类衍生物,经超滤处理后即可用于蛋白质N端氨基的定点修饰,并对其修饰尿酸酶的条件进行了优化。聚乙二醇中间体和目标产物的结构通过IR和1H NMR进行表征,目标产物的总收率达72.8%。对尿酸酶的初步修饰研究表明,化合物Ser-m PEG20000具有较好的修饰蛋白的能力,对尿酸酶的最佳修饰条件为:Ser-m PEG20000与尿酸酶物质的量比为2∶1,在溶液p H 5.0条件下,于25℃反应6 h。

注射用聚乙二醇化重组假丝酵母尿酸氧化酶中有机溶剂残留量顶空气相色谱检测方法的建立及验证

目的 建立注射用聚乙二醇化重组假丝酵母尿酸氧化酶SSS111中异丙醇(isopropanol,IPA)、二氯甲烷(dichloromethane,DCM)和甲苯(toluene,TOL)残留量的顶空气相色谱检测方法,并进行验证。方法 采用DB-1301毛细管柱(30 m×0.53 mm,1.0μm)。检测温度:250℃,进样温度:200℃,载气:氮气,分流比:3,柱流速:3.0 mL/min,氢气流速:60 mL/min,空气流速:400 mL/min。柱温采用程序升温,初始柱温:50℃,维持12 min,以40℃/min的速度升温至200℃,维持5 min。顶空瓶的平衡温度:120℃,平衡时间:20 min。验证方法的线性范围、精密性、准确性,确定检测限和定量限。采用建立的方法检测3批SSS111供试品中IPA、DCM和TOL的残留量。结果 IPA、DCM、TOL分别为0.001 982~7.928、0.002 118~8.472和0.041 960~8.392μg/mL时,与峰面积呈良好的线性关系,r均> 0.99;重复6次检测对照品溶液中IPA、DCM、TOL残留量的RSD均<5%;SSS111供试品中添加对照品溶液后检测IPA、DCM、TOL回收率均在80%~120%范围内;IPA、DCM、TOL的检测限分别为1.982、2.118、41.96 ng/mL,定量限分别为6.941、6.236、126.92 ng/mL。3批供试品溶液中的IPA残留量均低于检测限,DCM残留量约为1 ppm,TOL均<1 ppm。结论 建立的顶空气相色谱检测法具有良好的精密性、准确性,且操作简便,灵敏度较高,可用于SSS111中有机溶剂残留量的检测。

PEG化重组尿酸氧化酶蛋白含量测定方法研究

目的：以未修饰的原型蛋白为对照品，建立准确测定2种聚乙二醇化重组尿酸氧化酶（PEG-rUOX）含量的方法。方法：以原型蛋白rUOX为对照品，利用凝胶色谱法测定PEG-rUOX中的蛋白含量，通过详细的专属性、精密度、准确性等方法学考察，建立该方法。色谱条件：采用TSK Gel 5000PWxl（300 mm×7.8 mm）凝胶色谱柱，以含0.15 mol/L氯化钠的0.05 mol/L的Tris-HCl溶液（pH9.0）为流动相，流速0.5 mL/min，柱温为室温，检测波长280 nm。结果：在280 nm下，2种rUOX在200~1000μg/mL浓度范围内线性关系良好（r2分别为1和0.9999），其高、中、低平均回收率均较高，为98.33%~99.96%。结论：本方法专属性、精密度和准确性良好，可作为PEG-rUOX的含量测定方法。

静脉内输注PED尿酸氧化酶对难治性痛风有效

杜克大学JohnS．Sundy博士领导研究小组于3月的《关节炎和风湿病》（Arthritis Rheum，2007；56：1021—1028．）杂志上报告，静脉内使用聚乙二醇化重组哺乳动物尿酸氧化酶（PEG-尿酸氧化酶）对难治性痛风治疗有效，并被良好耐受。

聚乙二醇化蛋白质药物的问题与对策综述

从上世纪90年代聚乙二醇化药物进入临床以来,目前国内外上市的聚乙二醇修饰药物已经高达十余种。在过去20年中,聚乙二醇修饰技术被认为是最成熟的延长药物半衰期的技术,然而最近的研究报道提出,在使用聚乙二醇化药物进行的治疗过程中检测到抗PEG抗体的存在,极大地限制了聚乙二醇化药物的临床应用。综述聚乙二醇化药物的研究进展及尿酸酶这一典型聚乙二醇化药物的临床研究报道,并总结部分在未来有潜力替代聚乙二醇修饰技术的蛋白质修饰技术,为发掘新的药物修饰技术提供理论基础。

聚乙二醇(PEG)化尿酸氧化酶中游离PEG的含量测定

目的：比较并建立PEG化尿酸氧化酶中游离PEG的测定方法。方法：采用反相高效液相色谱-蒸发光散射检测器（ELSD）联用法和SDS—PAGE碘染的方法。RP—I-IPLC法的色谱柱为C。柱（4．6mm×250mm，5μm）；流动相A为0．1％（v／v）的三氟乙酸-水，流动相B为0．1％（v／v）的三氟乙酸-乙腈，梯度洗脱；流速为1．0mL·man～；柱温30℃；SDS—PAGE碘染采用氯化钡固定，碘-碘化钾染色。结果：RP—HPLC法中，PEG的检测灵敏度为0．2μg，PEG在1～6μ范围内呈良好的二项式回归关系（R^2=0．9993）。低、中、高3个浓度的加样回收率分别为96．2％、97．4％、96．8％。SDS—PAGE碘染法灵敏度为0．1μg。结论：建立的高效液相色谱一蒸发光散射检测器联用法与SDS—PAGE碘染法均可对游离PEG进行测定。前者测定结果准确，重复性好，可用于PEG的精确定量分析，后者操作简单，不需要特殊仪器。但只可用于限度检查。

新型Y型聚乙二醇-尿酸氧化酶修饰物的制备及免疫原性和生物活性评价

目的制备一种新型支链(Y型)聚乙二醇(Y-shape polyethylene glycol,PEG)修饰的尿酸氧化酶,并对该修饰酶的体外酶活性和稳定性,在大鼠体内药效学、药动学和免疫原性进行评估,为其临床研究给药方案的设计和优化提供依据。方法运用凝胶电泳、高效液相色谱技术研究聚乙二醇修饰产物的理化特征,采用酶反应-紫外分光光度法对酶生物活性进行检测,结合ELISA方法分析修饰酶的免疫原性。以大鼠为模型,研究不同聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶在体内的药动学。结果 Y型聚乙二醇尿酸氧化酶修饰物rUOX-mPEG2的表观相对分子质量比线性聚乙二醇修饰的产物rUOX-mPEG更大,聚乙二醇分子的修饰度更高,在相同温度和pH条件下的活性明显高于直链型聚乙二醇尿酸氧化酶修饰物。动物实验表明,该聚乙二醇-尿酸氧化酶修饰物在体内呈现良好的动力学特征,并在体内具有更长的药效维持时间。免疫原性实验结果也表明,Y型聚乙二醇修饰能有效降低免疫原性。结论 Y型聚乙二醇修饰尿酸氧化酶的酶学性质明显优于重组酶和直链型修饰的尿酸氧化酶,药效维持时间显著高于后者,免疫原性和国外品种采用的直链修饰尿酸氧化酶相当,且明显低于重组酶,在大鼠体内呈线性动力学特征。

重组猪尿酸氧化酶基因突变及其对聚乙二醇化的影响

目的对重组猪尿酸氧化酶(recombinant porcine urate oxidase,r PUOX)进行突变改造,以增加rPUOX上可供聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)耦合的赖氨酸(Lys)残基数,探究PEG修饰对改造前后的酶液在SPF鸡体内的药效和抗原屏蔽作用的影响。方法对纯化的基因改造前后的r PUOX进行PEG化修饰,修饰蛋白静脉注射SPF鸡,共4次,每次间隔7 d。实验分为20×5K PEG-rPUOX-215组、20×5K PEG-rPUOX组和空白对照组(0.9%生理盐水)。于鸡翼根静脉处采血,用血糖尿酸测试仪及尿酸测试条测定尿酸浓度,酶反应-紫外分光光度法检测尿酸酶活性,间接ELISA法检测免疫原性。结果 20×5K PEG-r PUOX-215和20×5K PEG-rPUOX均获得充分修饰,且前者修饰效果更好。第1、2次注射,降低鸡血尿酸幅度20×5K PEG-rPUOX-215组高于20×5K PEG-rPUOX组约11%和6%。3次注射药效维持时间20×5K PEG-rPUOX组相较于20×5K PEG-rPUOX-215组逐次降低0、24和48 h。20×5K PEG-rPUOX-215组抗体产生速率相对较慢,且14 d抗体阳性率低于20×5K PEG-rPUOX组约14.3%。结论 20×5K PEG-rPUOX-215修饰后药效学作用更显著,药物半衰期延长,且免疫原性相对较低,为研制低免疫原性的rPUOX及实现临床上多次给药提供了新的方法和思路。

聚乙二醇化重组人尿酸氧化酶质控难点研究进展

聚乙二醇化重组人尿酸氧化酶(PEG-UOX)是对重组人尿酸氧化酶(UOX)进行聚乙二醇修饰以降低其免疫原性和延长体内半衰期为目的的改构药物。由于它是聚乙二醇随机多位点修饰的蛋白药物,使得修饰后的蛋白质在理化性质以及体内外活性上的复杂程度都远远超出重组人尿酸氧化酶。对于此类药物,目前国内外无标准化的质量分析方法。笔者通过整理、归纳近年来关于聚乙二醇修饰药物质控分析技术的文献,对聚乙二醇化重组人尿酸氧化酶的3个关键质量控制难点——聚乙二醇对重组人尿酸氧化酶的平均修饰率、修饰均一度以及聚乙二醇在重组人尿酸氧化酶上的修饰位点所涉及的分析手段进行了综述,以期对国内企业开发此药物提供技术指导。

聚乙二醇化尿酸酶脂质体的稳定性研究

目的制备聚乙二醇化尿酸酶脂质体(PULPs)并考察其活性与稳定性。方法采用逆向蒸发法制备PULPs,并考察其最适温度、最适p H、热稳定性、贮存稳定性及其抗胰蛋白酶水解的能力、抗部分金属离子及有机化合物影响的能力。结果PULPs的最适温度为40℃,最适p H为8.5;PULPs的热稳定性、贮存稳定性、抗胰蛋白酶水解能力、抗部分金属离子及有机化合物影响的能力均优于尿酸酶。结论 PULPs在增强聚乙二醇化尿酸酶活性的同时增强了稳定性。

聚乙二醇化干扰素联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎疗效的影响因素

目的探讨聚乙二醇化干扰素(PegIFN)联合利巴韦林(RBV)治疗慢性丙型肝炎疗效的影响因素。方法回顾性分析2008年1月至2011年12月于宝鸡市中心医院接受Peg IFN和RBV联合治疗的148例HCV感染者的临床资料。采用持续性病毒应答24周(SVR24)、早期病毒学应答(EVR)、治疗结束病毒应答(ETR)、持续性病毒应答12周(SVR12)、复发、无效应答、病毒学突破评估疗效,Logistic回归分析影响疗效的因素。结果 148例HCV感染者失访12例(8.1%)。136例HCV感染者中128例(94.1%)患者出现EVR、118例(86.8%)患者出现ETR、114例(83.8%)患者出现SVR12、112例(82.4%)患者出现SVR24、8例(5.9%)患者无效应答、6例(4.4%)患者复发、4例患者出现病毒学突破(2.9%)。HCV RNA、HCV基因型和UA均为影响HCV感染者SVR24的因素(P均<0.05)。结论 PegIFN联合RBV治疗HCV感染疗效显著。HCV基因型2/3、HCV RNA水平较低和尿酸与HCV SVR相关。

痛风药物治疗进展

痛风的生化标志是高尿酸血症,后者不仅可侵犯骨和关节,而且易累及肾脏和心血管系统。控制血液尿酸水平可有效治疗痛风,减少上述并发症的发生。本文结合相关疗效评价研究,综述痛风治疗新药非布索坦、处于研发后期的降尿酸药物及临床治疗方案开发进展。

其它——Krystexxa获FDA完全回应函

Savient公司的痛风治疗药Krystexxa（pegloticase）因FDA的完全回应函而受到打击。该公司申请此药用于常规治疗难治性慢性痛风病人的治疗。Krystexxa是一种聚乙二醇化重组哺乳动物尿酸氧化酶，打算用于控制痛风病人的血尿酸过高和它的临床后果。

Savient公司在欧洲寻找合作伙伴

Savient制药公司正为在欧洲上市其产品Puricase（聚乙二醇化-尿酸酶）（Ⅰ）寻找合作伙伴。目前（Ⅰ）处于Ⅲ期临床试验中，是一种聚乙烯羟乙酸盐重组猪尿酸酶，可分解并消除尿酸，从而有效减少组织中的痛风石（尿酸结晶的结节块）。

Puricase有望用于痛风

Savient制药公司的Puricase（聚乙二醇化重组猪尿酸酶）（Ⅰ）用于有症状痛风患者的Ⅱ期临床试验的主要结果呈阳性。（Ⅰ）已在美国获得罕见病药地位。