聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的制备及其对培养猪肝细胞的影响

目的:制备聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子并探讨其对培养猪肝细胞形态和功能的影响．方法:以聚乳酸和O-羧甲基壳聚糖为基质材料,采用超声波法制备了聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子,用原子力显微镜对其进行了物理表征,用X射线光电子光谱法对其表面的化学结构进行了表征．用聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子进行原代猪肝细胞培养,并以普通培养作为对照组．观察培养后1 wk内肝细胞的形态和功能变化．结果:聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子制备成功,原子力显微镜下其直径300-500 nm．经过XPS光谱分析显示,C,O,N的比例分别为72．51％,23．69％,3．80％．普通培养的肝细胞,48 h后逐渐失去多边形特征．而与PLA-O- CMC共培养48 h后,肝细胞形成细胞黏附聚集的球形体,大部分肝细胞重建细胞极性,呈现较典型、均匀的多边形形态特征．培养后 24 h,3 d和5 d时,纳米细胞培养组ALB含量高于普通培养组(3．53±0．052,3．48±0．075,3．57 ±0．137g/L vs 3．10±0．179,3．17±0．186,3．10 ±0．219 g／L,均P<0．05);3,5,7 d时,纳米细胞培养组ALT水平明显低于普通组(15．33± 13．05,8．84±8．87,7．00±5．22 nkat／L vs 24．17 ±20.35,16．17±27．49,15．50±11．95 nkat／L, 均P<0．05),而BUN含量虽然有所升高,但是不显著(P>0．05)．结论:聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子是肝细胞培养的良好材料．

载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子制备、表征及其对培养大鼠肝细胞活力的影响

背景:肝细胞生长因子半衰期短,且不具有靶向性。成熟肝细胞体外大量培养及活力维持难度较大,严重制约肝细胞移植及生物人工肝的临床应用。目的:制备并表征载肝细胞生长因子的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子,探讨其体外降解、释药行为及对培养大鼠肝细胞活力的影响。设计、时间及地点:对比观察实验,于2006-07/2008-01在南通大学肝胆外科研究所及南通大学江苏省神经再生重点实验室设计完成。材料:SD大鼠10只,肝细胞生长因子由英国PeproTech公司提供,聚乳酸由美国Sigma公司提供,O-羧甲基壳聚糖由上海伟康生物技术有限公司提供。方法:以聚乳酸和O-羧甲基壳聚糖为基质材料,采用超声波法制备聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子,用低温磁力搅拌法制备载肝细胞生长因子的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子。用该载药纳米粒子进行原代大鼠肝细胞培养,并以不加肝细胞生长因子的普通培养作为对照,采用CCK-8体外细胞增殖检测试剂盒检测培养肝细胞活力。主要观察指标:观察该载药纳米粒子的结构、粒径及表面形貌,测定其粒径分布和表面电位,动态监测降解过程中粒子表面形貌的变化、降解过程中质量的损失情况和降解介质的pH值变化情况。并进一步检测培养1周内肝细胞的活力。结果:载肝细胞生长因子的PLA-O-CMC纳米粒子呈球形,其平均粒径为140nm,粒径分布指数为0.108,载药率为0.12665%,包封率为76.32%,粒子表面电位为32.8eV。该载药纳米粒子前24h释药动力学方程为Q=148.4266+189.0493t1/2(R=0.97589),符合Huguchi方程;前30d内释放动力学方程Q=1086.28966+58.23938t(R=0.99716),符合零级释放方程。载药纳米粒子组肝细胞活力明显高于普通培养组(P<0.05)。结论:实验成功制备并表征了载肝细胞生长因子的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子,并证实其能够有效维持培养大鼠肝细胞的活力。

聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子对大鼠腹腔内猪肝细胞异种移植免疫排斥反应的影响

背景:课题组前期实验用I型胶原包埋聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子黏附培养的猪肝细胞治疗急性肝衰竭大鼠取得了良好的疗效。目的:进一步观察聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子在猪肝细胞腹腔内移植治疗急性肝衰竭大鼠过程中对免疫排斥反应的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-05/2006-05在南通大学肝胆外科研究所和神经再生实验室完成。材料:原位胶原酶循环肝灌注法分离猪肝细胞;SD大鼠64只D-氨基半乳糖腹腔内注射制作急性肝衰竭模型。方法:64只模型大鼠随机分为4组:模型组不干预;纳米胶原肝细胞组将Ⅰ型胶原凝胶包埋的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子黏附培养24h的猪肝细胞植入大鼠腹腔内,并用大网膜适当包裹;胶原肝细胞组将Ⅰ型胶原凝胶固定培养24h的猪肝细胞植入大鼠腹腔内;单纯肝细胞组将振荡培养24h的猪肝细胞悬液直视下注入大鼠的小网膜囊内。移植在造模48h后进行,移植细胞量均为5.0×107个肝细胞。主要观察指标:移植后1,2,3,5,7d取大鼠血清检测白细胞介素2、干扰素γ、IgG、IgM浓度,以模型组数据为移植前指标;移植后1,3,7d取腹腔移植物光镜下观察移植肝细胞的病理变化。结果:移植后7d内各组血清白细胞介素2、干扰素γ水平差异无显著性。各组血清IgG水平在移植后逐渐升高,第3天达到最高峰,随后逐渐下降;移植后2,3d,纳米胶原肝细胞组血清IgG质量浓度低于其他2组(P<0.05),至移植后7d,纳米胶原肝细胞组血清IgG水平高于单纯肝细胞组(P<0.05)。各组血清IgM质量浓度在移植后第1,2天明显低于移植前(P<0.05),移植后第3～7天逐渐升高,其中纳米胶原肝细胞组IgM质量浓度高于其他2组(P<0.05)。移植后第3天胶原肝细胞组移植肝细胞数量明显减少,单纯肝细胞组则几乎找不到存活的肝细胞,而纳米胶原肝细胞组移植后第7天仍能找到存活肝细胞。结论:聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子在猪肝细胞腹腔内移植治疗大鼠急性肝衰竭过程中对体液免疫排斥反应具有一定的抑制作用。

聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子培养的猪肝细胞移植对大鼠急性肝衰竭的治疗作用

目的：探讨胶原凝胶包埋的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子培养的猪肝细胞腹腔内移植对急性肝衰竭（ALF）大鼠的治疗效果。方法：D-氨基半乳糖腹腔内注射制作大鼠ALF模型。48h后分别将培养24h的猪肝细胞悬液（含5.0×10^7个肝细胞，I组）、I型胶原凝胶固定培养24h的猪肝细胞（含5.0×10^7个肝细胞，Ⅱ组）、I型胶原凝胶包埋的PL-A-O-CMC纳米粒子培养24h的猪肝细胞（含5.0×10^7个肝细胞，Ⅲ组）移植到ALF大鼠腹腔内，并以RPMIl640腹腔内注射作为对照（IV组）。观察移植后大鼠14d存活率，血清白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、总胆红素（TB）、血氨（NH3）的变化和移植肝细胞的病理变化。结果：移植后14d ALF大鼠的存活率：I组为56.25％，Ⅱ组为62.5％，Ⅲ组为75％，Ⅳ组为18.75％，各移植组高于对照组（P＜O.05）。移植后1～5d，I、Ⅱ、Ⅲ组各项肝功能指标改善明显优于Ⅳ组，Ⅲ组肝功能恢复好于同时间其它移植组，肝功能恢复从快到慢依次为Ⅲ、Ⅱ、I、Ⅳ组。Ⅲ组移植肝细胞存活时间最长，炎症浸润最轻。结论：应用胶原凝胶包埋的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子培养的猪肝细胞腹腔内移植治疗ALF大鼠能显著改善肝功能、提高生存率，聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子用于异种肝细胞移植具有良好的生物相容性，并能延长移植肝细胞的存活时间。关键词肝细胞移植；急性肝衰竭；聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖；

聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子培养的猪肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠肝再生的影响

我们将聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖（PLA-O-CMC）纳米粒子培养的猪肝细胞移植到急性肝衰竭（ALF）大鼠腹腔内，观察移植后血浆中肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子（VEGF）的变化及受体肝脏病理改变，探讨其对ALF大鼠肝再生的影响。

聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子对大鼠腹腔内异种移植猪肝细胞bcl-2、bax、Fas和p53表达的影响

我们采用免疫组织化学方法观察聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖（PLA-O-CMC）纳米粒子对腹腔内异种移植猪肝细胞凋亡相关蛋白bcl-2、bax、Fas和p53表达的影响。

新型羧甲基壳聚糖-聚乳酸-聚乙二醇共聚物合成及细胞相容性

目的将聚乳酸(PLA)与聚乙二醇(PEG)接枝聚合到羧甲基壳聚糖(CMCS)上,利用PLA的可降解性和PEG的亲水性对CMCS进行改性,并研究共聚物的细胞相容性。方法以乳酸为原料,锌粉为催化剂在高温真空环境下聚合制备丙交酯,PEG开环丙交酯制备PEG-PLA两嵌段共聚物;以PEG-PLA为原料、DCC为偶联剂来制备中间体PEG-PLACHO,与CMCS反应最终得到产物CMCS-PLA-PEG,并对合成的产物进行核磁共振氢谱及红外光谱检测,以确认结构;使L929细胞与得到的聚合物共培养,利用细胞噻唑蓝(MTT)方法,检测共聚物的细胞相容性。结果用L-乳酸成功合成L-丙交酯,相对分子质量为144;然后利用PEG对丙交酯开环聚合得到PEG-PLA,相对分子质量为12 290;对PEGPLA-OH进行醛化,与CMCS反应得到最终产物CMCS-PLA-PEG,相对分子质量为223 670。将CMCS-PLA-PEG浸提液与L929细胞共培养,细胞相对生长率均在90%以上。表明新型共聚物CMCS-PLA-PEG浸提液不影响L929细胞的生长,无细胞毒性,具有较好的细胞相容性。结论新型CMCS-PLA-PEG的细胞相容性良好,具有应用于生物医学领域的潜力。

N-月桂基-O-羧甲基壳聚糖合成的研究

以甲壳素为原料,首先合成O-羧甲基壳聚糖,然后通过混合冻干得到N-月桂基-O-羧甲基壳聚糖,最后得到两亲性壳聚糖包封的紫杉醇聚胶束溶液.

6-O-羧甲基壳聚糖对人增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β_1表达的影响

目的:观察不同浓度6-O-羧甲基壳聚糖(6-O-CMC)对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibrob lasts,HSFBs)转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)蛋白及mRNA表达的影响,在分子水平上探讨其抑制增生性瘢痕生长的作用机制。方法:体外培养人HSFBs,选取第3～5代细胞进行下一步实验。实验分组采用含不同浓度6-O-CMC(0,100,200,400μg/ml)的DMEM培养液分别进行培养。培养24h后,显微镜下观察各组HSFBs形态及生长情况。收集细胞培养上清,运用双抗体夹心ELISA法检测各组TGF-β1蛋白表达水平。运用荧光定量RT-PCR技术检测各组TGF-β1 mRNA表达水平。结果:与空白组相比,三个药物剂量组HSFBs TGF-β1蛋白及mRNA的表达均减少(P<0.05),药物浓度越高表达量越低(P<0.05),且TGF-β1蛋白及mRNA表达的变化具有一致性。结论:6-O-CMC有抑制体外培养的人HSFBs TGF-β1表达的作用,初步探讨了6-O-CMC发挥抑制增生性瘢痕生长的作用机制,为羧甲基壳聚糖类药物的开发利用提供理论依据。

N-琥珀酰-O-羧甲基壳聚糖对喜树碱的增溶及控制释放

研究N-琥珀酰-O-羧甲基壳聚糖（NSOCMCS）在稀溶液中形成的聚集体对疏水的抗癌药物喜树碱（CPT）的增溶及控制释放作用.透射电镜（TEM）分析结果表明,NSOCMCS聚集体负载CPT后尺寸明显增大;荧光光谱分析结果表明,CPT在NSOCMCS溶液中的溶解度比其在水中的溶解度增大2～3倍;体外释放实验结果表明,NSOCMCS对于CPT具有一定的缓释作用.因此,NSOCMCS是一种具有应用潜力的疏水抗肿瘤药物释放载体材料.

6-O-羧甲基壳聚糖的硫酸酯化及其产物的抗凝血活性

以甲壳素为原料,采用低温羧甲基化反应制备C6位取代羧甲基甲壳素(6-O-CMCH),然后脱去C2位乙酰基得到C6位取代羧甲基壳聚糖(6-O-CMCS),最后将6-O-CMCS与氯磺酸-浓硫酸反应,通过控制反应条件,获得了取代位置和取代度部分可控的硫酸酯化6-O-CMCS。利用电位滴定、元素分析、FT-IR、1 H-NMR测试分析各级产物的化学结构,并测定终产物活化部分的凝血活酶时间(APTT)、血浆凝血酶原时间(PT)及血浆凝血酶时间(TT)。实验结果表明:硫酸酯化6-O-CMCS与高分子量肝素的结构和抗凝血活性类似,其抗凝血活性机理主要体现在对内源性和共同凝血途径的抑制。

聚乳酸载药纳米微粒的表面修饰及体外评价

本研究的目的是用O 羧甲基壳聚糖作乳化剂和表面修饰剂 ,采用超声乳化法制备聚乳酸载药纳米微粒 ,并对聚乳酸载药纳米微粒进行表面修饰 ,然后分别对载药纳米微粒的表面形貌、粒径分布、微粒结构、表面元素、体外释放和肿瘤细胞抑制率等微粒性能进行考察与评价。实验证明 ,O 羧甲基壳聚糖可用于制备纳米药物载体系统 ,对聚乳酸载药纳米微粒的制备起到很好的乳化性能和表面修饰作用。采用复乳法制备包载 5 Fu的PLA/O CMC纳米微粒的平均粒径在 5 0nm ,在PBS缓冲溶液中释放时间可达 12d。在对胃癌、乳腺癌和大肠癌三种肿瘤细胞的抑制率测定实验中 ,PLA/O CMC纳米微粒的肿瘤细胞抑制率分别可以达到 72 .8%、77.3%和 75 .6 % ,接近或等同于游离 5 Fu药物的抑制率。在作用时间上 ,PLA/O CMC载药纳米微粒也显示出良好的缓释效应。

PLA-O-CMC纳米粒子培养的猪肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠肝再生作用的初步研究

目的:探讨胶原凝胶包埋聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖(PLA-O-CMC)纳米粒子粘附培养猪肝细胞移植对急性肝衰竭(ALF)大鼠肝的再生作用。方法:D-氨基半乳糖腹腔内注射制作大鼠ALF模型;48h后分别将5mlⅠ型胶原凝胶包埋的PLA-O-CMC纳米粒子粘附培养24h猪的肝细胞、5mlⅠ型胶原凝胶固定培养24h的猪肝细胞、5ml培养24h的猪肝细胞悬液(均含5.0×107个)移植到各组ALF大鼠腹腔内,并以5mlRPMI1640腹腔内注射作为阴性对照。观察大鼠14天存活率和受体肝脏的病理变化。结果:移植后14天ALF大鼠的存活率:单纯肝细胞移植组(Ⅰ组)为56.25%,胶原肝细胞移植组(Ⅱ组)为62.5%,纳米胶原肝细胞移植组(Ⅲ组)为75%,阴性对照组(Ⅳ组)为18.75%,各移植组14天存活率高于对照组(P<0.05),各移植组间无统计学意义(P>0.05)。ALF大鼠肝脏再生于ALF后5～7天最为显著;各组肝脏病理变化以Ⅲ组恢复最好,双核细胞最多,肝再生最快。结论:应用PLA-O-CMC纳米粒子和Ⅰ型胶原联合培养猪肝细胞移植于ALF大鼠腹腔内能促进肝脏的再生。

新型壳聚糖基自组装纳米胶束紫杉醇药物释放载体

以N-胆甾醇琥珀酰基-O-羧甲基壳聚糖(CCMC,胆甾醇基取代度6.9%)为原料,在水溶液中通过探头超声处理制备其自组装凝胶纳米胶束,采用稳态荧光探针法考察临界胶束浓度,并通过透射电镜和动态激光散射仪检测胶束的形态大小.以紫杉醇为模型药物,采用透析法制备载药CCMC纳米胶束,并通过高效液相色谱法(HPLC)考察其在纳米胶束中的包载及释放情况.结果显示,CCMC为两亲性高分子,在水溶液中能形成粒径为198.4 nm的规则球状胶束,临界胶束浓度为0.018 mg/mL.紫杉醇顺利包载于CCMC-纳米胶束内,载药量高达34.9%;随着载药量的增加,胶束粒径呈增大的趋势.体外释放实验结果显示,CCMC纳米胶束能延缓紫杉醇的释放,释药速度和释放介质pH值密切相关.

N-半乳糖-O-组胺酰化羧甲基壳聚糖纳米胶束的制备与性能

将半乳糖配基和组胺接枝到O-羧甲基壳聚糖合成了N-半乳糖-O-组胺酰化羧甲基壳聚糖,采用探针式超声法将其制备成pH敏感型纳米胶束,并采用透析法研究了该纳米胶束载药后的释放性能.结果表明,该纳米胶束在pH 7.4（正常组织pH值）时呈球形,平均粒径介于106.1~173.6 nm之间,而载药纳米胶束在pH 6.5（癌组织pH值）时强烈释放药物.该纳米胶束有望作为pH敏感型纳米药物载体.

复合胶原纳米粒子在猪肝细胞培养中的应用

目的:制备聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖(PLA-O-CMC)纳米材料和Ⅰ型胶原复合物进行猪肝细胞的体外培养。方法:用超声乳化法制备PLA-O-CMC纳米粒子,扫描电镜对其进行表征。采用Ⅳ型胶原酶原位循环灌流法分离猪肝细胞。将肝细胞分为:Ⅰ组(裸细胞培养组)、Ⅱ组(复合胶原纳米粒子细胞混合培养组)进行培养,观察肝细胞形态结构及功能变化。结果:PLA-0-CMC纳米粒子及Ⅰ型胶原为肝细胞的生长提供了良好的支架和外环境,体外肝细胞的生长也从平面型向三维型迈出了较大的一步。培养猪肝细胞能保持良好的活性和白蛋白分泌功能。结论:PLA-0-CMC纳米粒子及Ⅰ型胶原体为肝细胞生长的良好载体。

一种新型高效保湿剂的吸湿保湿动力学研究

通过分子设计,合成了一种新型高效的保湿剂,N-羧丁酰基-O-羧甲基壳聚糖(CB-CMCS),其吸湿保湿效果优于透明质酸.重点研究了该保湿剂和透明质酸的吸湿保湿动力学特性,结果表明采用二级吸附动力学方程能够很好的描述两种保湿剂的吸湿行为,相关系数均达0.999以上,由此说明它们的吸湿过程主要受化学作用的控制.

PLGA/O-CMC载药纳米微粒的体外降解及释药行为研究

本研究以聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)和自行制备的O羧甲基壳聚糖(OCMC)为原料,以5氟尿嘧啶(5FU)为抗癌药物模型,采用自身设计的改良复乳法制备了载药纳米微粒。微粒平均粒径为98.5nm,粒径分布指数为0.192,粒子表面ξ电位为61.48eV,载药率高达18.9%。然后用SEM动态监测载药纳米粒子降解过程中表面形貌的变化,并连续追踪粒子降解过程中的质量损失和降解介质的pH变化。载药纳米粒子在PBS中的释药行为研究表明,(1)前12h的释药动力学符合Huguchi方程,具有一级释放特性;(2)在20d内的释药动力学符合零级释放特性。细胞凋亡实验结果表明载药纳米粒子对TJ905脑胶质瘤细胞增殖有明显的抑制作用。

同载基因和药物的超微载体粒子的制备及体外评价

以聚乳酸_乙醇酸共聚物 (PLGA)和自行制备的O_羧甲基壳聚糖 (O_CMC)为原料 ,以 5_氟尿嘧啶 (5 Fu)为抗癌药物模型 ,以反义EGFR(表皮生长因子受体 )为基因药物模型 ,构建与评价了同载抗癌药物与基因的复合功能纳米药物载体系统。同载超微粒子的平均粒径为 2 5 8 7nm ,粒径分布指数为 0 14 2 ,粒子表面 ξ电位为 - 10 6 7eV。同载超微粒子在PBS中的释药行为研究表明 :超微粒子中 5_FU和基因均具有零级缓慢释放特性。体外肿瘤细胞存活率实验和免疫组化实验均证实同载超微粒子能高效抑制TJ90 5人脑胶质瘤细胞的增殖。最后用荧光共聚焦显微镜动态监测了超微粒子进入瘤细胞的转染过程 ,发现粒子可在不同时间内进入细胞浆和细胞核。

PLGA/O-CMC载药纳米粒子的体外释药行为研究

本文以聚乳酸_乙醇酸共聚物 (PLGA)和自行制备的O_羧甲基壳聚糖 (O_CMC)为原料 ,以5_氟尿嘧啶 (5_FU)为抗癌药物模型 ,采用自身设计的改良复乳法制备了载药纳米微粒。微粒平均粒径为 98 5nm ,粒径分布指数为 0 192 ,粒子表面 ξ电位为 6 1 4 8eV ,载药率高达 18 9% ,包封率为86 %。然后用SEM动态监测载药纳米粒子降解过程中表面形貌的变化 ,并连续追踪粒子降解过程中的质量损失和降解介质的pH变化。载药纳米粒子在PBS中的释药行为研究表明 :(1)前 12h的释药动力学符合Huguchi方程 ,具有一级释放特性 ;(2 )在 2